SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

增多，蛋白酶和淀粉酶呈现上升趋势，这可能与养殖

动物的种类和食性有关。

相比于对照组，低替代组（≤28.6%）仍表现出更

高的消化酶活性（无明显差异），这可能是因为在适宜

范围内，饲料中蛋白源组成的差异造成蛋白酶的适应

性现象[37]

。此外，发酵玉米蛋白粉中含有较多有益

菌，可以改善肠道pH，使肠道中相关酶在更适宜环境

中发挥活性[13]

。结合本研究结果，这可能是低替代水

平斑节对虾蛋白酶和淀粉酶活性上升的原因之一。

本研究中，用发酵玉米蛋白粉替代42.8%鱼粉对

生长性能、免疫指标及消化酶活性均未有显著差异，

其最大替代水平高于玉米蛋白粉替代鱼粉在对虾上

的其他研究水平：10%~15%[4，39]

。可能原因之一，就

是发酵玉米蛋白粉相比于玉米蛋白粉有更多优势，是

更适宜的鱼粉替代植物蛋白源；另一原因是，本研究

在配方中添加了足量的甜菜碱，改善添加植物蛋白导

致的适口性差问题，进而提高摄食，这也进一步证明

保障摄食量是提高鱼粉替代比例的有效途径之一。

4 结论

综上所述，发酵玉米蛋白粉可替代 42.8% 的鱼

粉，而当替代量超过42.8%时会抑制斑节对虾生长性

能和饲料利用率，生长性能受影响可能和消化能力下

降有关。

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71

生 物 技 术 2023年第44卷第18期 总第687期

作者简介：袁丽红，硕士，研究方向为单胃动物营养与饲

料科学。

*通讯作者：程志斌，副教授。

收稿日期：2023-05-17

基金项目：云南省重大科技专项[2016ZA008]；云南省创

新团队项目[2017HC030]

饲 用 枯 草 芽 孢 杆 菌 抑 菌 性 能 的 研 究 进 展

■ 袁丽红1 柳成东2 肖明霞1

PHOUTHAPANE Vanhnaseng3 安清聪1 程志斌1*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.福建傲农生物科技集团股份有限公司，福建漳州 363000；

3.老挝农林部畜牧与水产局，老挝万象 6644）

摘 要：文章综述枯草芽孢杆菌在体内、体外的抑菌性能，旨在保障枯草芽孢杆菌的饲用效果，

重点总结3方面：其一，枯草芽孢杆菌抑菌性能评估方法；其二，枯草芽孢杆菌的体外抑菌作用（牛津

杯法体外抑菌试验评估）；其三，饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控效果（体内抑菌试验评

估）。体外试验文献显示，枯草芽孢杆菌对肠道有害菌和饲料源有害菌的抑菌报道较多，对肠道有益

菌和其他商业益生菌的抑制研究很少，且不同菌株的抑菌性能差异较大，这与饲用枯草芽孢杆菌对

畜禽肠道有益菌及个别有害菌调控出现差异化结果相符。文章建议完善枯草芽孢杆菌体外抑菌评

估的体系，这有助于筛选安全的菌株及高效地研制单一和复合饲用枯草芽孢杆菌制剂。

关键词：枯草芽孢杆菌；抑菌性能；牛津杯法；肠道菌群检测；研究进展

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.011

中图分类号：S816.3 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0072-07

Advancement on Antibacterial Properties of Probiotic Bacillus subtilis

YUAN Lihong1

LIU Chengdong2

XIAO Mingxia1

PHOUTHAPANE Vanhnaseng3

AN Qingcong1

CHENG Zhibin1*

(1. College of Animal Science and Technology of Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming

650201, China; 2. Fujian Aonong Biotechnology Group Co., Ltd., Fujian Zhangzhou 363000, China;

3. Department of Livestock and Fisheries, Ministry of Agriculture and Forestry of Laos, Vientiane 6644, Laos)

Abstract：The in vitro and in vivo antibacterial

properties of probiotic Bacillus subtilis were re⁃

viewed in order to ensure the application of probi⁃

otic Bacillus subtilis. This paper focused on three

aspects as followings: ① evaluation method of an⁃

tibacterial properties of Bacillus subtilis; ② in vi⁃

tro bacteriostatic evaluation of Bacillus subtilis (ox⁃

ford cup test); ③ bacteriostatic regulation of di⁃

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（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

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72

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是全球及我国畜

牧业应用最广的饲用益生菌[1-3]

，其改善畜禽生产性

能的机制主要与菌株的抑菌性能及其调控肠道菌群

的作用有关[4-7]

。然而，本课题组汇总国内外大量枯

草芽孢杆菌抑菌试验和动物试验的报道发现，饲用枯

草芽孢杆菌的菌株繁多，菌株抑菌性能的评估客观存

在“评估方法繁杂、抑菌标准不统一、研究系统性不

足”等问题，致使动物饲养试验表现的生产性能产生

差异化结果。鉴于此，文章提出了枯草芽孢杆菌体外

抑菌性能评估研究的方向，以保障饲用枯草芽孢杆菌

应用于养殖业的作用效果及其稳定性。

1 枯草芽孢杆菌抑菌性能的评估方法及标准

与大多数饲用益生菌相似，枯草芽孢杆菌抑菌性

能的研究主要包括体外抑菌试验评估（in vitro bacte⁃

riostatic evaluation）和体内抑菌试验评估（in vivo bac⁃

teriostatic evaluation）两方面[8]

。

1.1 体外抑菌试验

已用于枯草芽孢杆菌体外抑菌实验的评估方法主

要包括：琼脂扩散法（包括牛津杯法、打孔法、滤纸片法

等）、最小抑菌浓度法、平板划线法和混培法等[9-11]

。其

中，牛津杯法具备可定量、操作方便的优势[9]

，因此采

用该法的研究文献最多。

汇总以往牛津杯法评估枯草芽孢杆菌抑菌性能

的试验文献，发现以下问题：其一，体外抑菌研究的系

统性不足。大量已报道的研究集中在枯草芽孢杆菌

对动物肠道有害菌及饲料源有害菌的抑制作用，对肠

道有益菌可能的抑制作用及对其他商业饲用益生菌

的可能拮抗效应基本没有报道，这显然不利于评估单

一或复合枯草芽孢杆菌制剂在养殖生产中的应用效

果；其二：体外抑菌作用的判定标准尚未统一。牛津

杯法以抑菌圈直径值(diameter of inhibition zone, DIZ)

来判断抑制作用的强弱，但迄今为止DIZ判定标准尚

未统一。韩旭凯［12］

采用的抑菌判定标准包括3个DIZ

区间值：“高敏感”（DIZ>20 mm）、“敏感”（8 mm<DIZ≤

20 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。Liang 等[13]

采用

的 抑 菌 判 定 标 准包括 5 个 DIZ 区间值：“极敏感”

（DIZ>20 mm）、“高敏感”（15 mm<DIZ≤20 mm）、“中敏

感”（10 mm<DIZ≤15 mm）、“低敏感”（7.80 mm<DIZ≤

10 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。显然，就表 1 汇

总的牛津杯抑菌数据，Liang等[13]

抑菌判定标准更加细

致。因此，文章综述后续描述采纳Liang等[13]

的标准。

1.2 体内抑菌试验

体内抑菌试验一般通过检测饲喂枯草芽孢杆菌

制剂的畜禽肠道食糜或粪便中特定细菌的数量（包括

肠道有害菌、肠道有益菌），来评估饲用枯草芽孢杆菌

对肠菌群的调控效果。肠道特定细菌数量(或相对数

量)的检测方法，主要包括宏基因组测序法[1]

、实时荧

光定量PCR法[3]

、平板计数法等[14-15]

。

1.2.1 宏基因组测序法

宏基因组测序法的优点是能从细菌分类学角度，

详细地分析饲喂枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群“门纲

目科属种”的影响，且当前检测仪先进，因此分析工作

效率极高。然而，该方法的最大缺点是只能给出菌群

丰度值，无法定量某一特定肠道菌的数量级。例如：

在产气荚膜梭菌攻毒动物模型条件下，宏基因组测序

法只能分析肠道中梭菌属细菌的相对丰度，无法定量

攻毒产气荚膜梭菌的数量级及变化[1]

。

1.2.2 实时荧光定量PCR法

相对宏基因组测序法难以定量肠道特定菌的数

量级，实时荧光定量PCR法的优点是可高效检测肠道

etary Bacillus subtilis supplementation on animal intestinal microflora (in vivo bacteriostatic test). In vitro

bacteriostasis of Bacillus subtilis on animal intestinal harmful bacteria and feed source harmful bacteria

was intensively reported, while the inhibition of Bacillus subtilis on animal intestinal beneficial bacteria

or other commercial feed probiotics were little known. Moreover, the in vitro antibacterial activities of var⁃

ious strains of Bacillus subtilis were greatly different. The above characteristics were also reflected in the

evaluation of in vivo bacteriostasis tests. Especially, the regulation of Bacillus subtilis additive on animal

intestinal beneficial bacteria and individual intestinal harmful bacteria were acutely differentiated. In con⁃

clusion, this review suggested the improvement of in vitro bacteriostatic evaluation system on probiotic

Bacillus subtilis was facilitated to screen the safe strains and further efficiently develop single or com⁃

pound Bacillus subtilis feed additives.

Key words：Bacillus subtilis; antibacterial properties; oxford cup test; intestinal flora testing; advancement

73

生 物 技 术 2023年第44卷第18期 总第687期

特定菌的数量级[3]

。然而，实时荧光定量 PCR 法的明

显缺点是无法进一步分析肠道总厌氧菌、总需氧菌的

数量级及其之间的比例，而肠道总厌氧菌及总需氧菌

数量是表征肠道菌群平衡的重要指标之一。

1.2.3 平板计数法

平板计数法最大的优点是操作简单、结果直观，且

能满足对表征畜禽肠道菌群平衡状态的总菌数、总厌

氧菌、总需氧菌以及某些特定肠道细菌(大肠杆菌、沙

门氏菌、产气荚膜梭菌等肠道有害菌；乳酸杆菌、双歧

杆菌等肠道有益菌)的数量级进行平板计数定量[14-15]

。

诚然，定量计数均需特定的培养基及培养条件，因此

平板计数法的缺点是分析工作效率低。

综上分析，基于可定量的报道数据，表 1 汇总了

体外抑菌试验评估枯草芽孢杆菌的抑菌作用(牛津杯

法)，表2汇总了体内抑菌试验评估饲用枯草芽孢杆菌

对畜禽肠道菌群的调控作用(平板计数法)。文章重点

阐述枯草芽孢杆菌体外抑菌作用评估，并与肠菌群调

控结果相互印证。

2 枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌的抑菌作用

大部分研究发现，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌、沙

门氏菌、梭菌等属的致病菌的作用机制主要包括以下

几个方面：①生物夺氧学说：枯草芽孢杆菌在繁殖过

程中均可消耗肠道内的氧气，造成局部厌氧环境，促

进厌氧菌的繁殖和生长；②菌群屏障学说：枯草芽孢

杆菌在消化道生成致密的膜菌群，枯草芽孢杆菌能与

致病菌争夺生存空间、定居位点、繁殖空间以及营养

物质，从而抑制病原菌的生长与繁殖；③抗菌物质：枯

草芽抱杆菌能够产生枯草菌素和枯草杆菌素等两种

小分子细菌素；枯草芽孢杆菌分泌几丁质酶作用于真

菌细胞壁，β-葡聚糖酶因其能水解 β（1→3）糖苷键所

以具抗真菌作用。它们可以通过完全降解病原菌细

胞壁来抑制病原菌生长；枯草芽孢杆菌还可以产生的

抗菌多肽，从而对致病菌产生抑制作用[1，3，12]

。

2.1 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌作用

表 1 汇总了 18 篇枯草芽孢杆菌对大肠杆菌体外

抑菌的 DIZ 数据，并参考 Liang等[13]

的抑菌判定标准，

分析如下：①极敏感：18篇文献中的 3篇文献[16-18]

，包

括谢晓佩等[16]

发现三株枯草芽孢杆菌(KC5、KC6、

KC7)、王琦等[17]

报道的 3个菌株(Yak-KC5、Yak-KC6、

Yak-KC7)、庄国宏等[18]

显示菌株GD，均对大肠杆菌的

DIZ达到 20 mm以上，有极强的抑制作用；②高敏感：

6 篇文献显示[16-21]

，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌 DIZ 范

围为15~20 mm，有良好的抑制作用；③中敏感：8篇文

献显示[19，22-28]

，枯草芽孢杆菌对大肠杆菌 DIZ 范围为

10~15 mm，有一定的抑制作用；④低敏感：Liang 等[13]

和辛娜等[28]

报道 2 株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌 DIZ

范围为 7.8~10 mm，抑制作用偏弱；⑤不敏感：5 篇文

献显示[28-32]

，多株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌 DIZ 为

7.8 mm，无抑制作用。以上结果提示，不同菌株的枯

草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制作用有显著差异。

表 2汇总了多篇饲用枯草芽孢杆菌对鸡、猪肠道

食糜或粪便大肠杆菌数量（平板计数法）影响的动物

试验结果。其一：肉鸡饲养试验。齐博等[34]

在鸡饲粮

中添加较低剂量枯草芽孢杆菌（105

CFU/g）发现，与

对照组（基础饲粮组，BD）相比，试验组（枯草芽孢杆

菌组，PD）肉鸡 21 日龄和 42 日龄的盲肠食糜大肠杆

菌数量未显著降低。袁文菊等[37]

和 Jeong等[15]

研究显

示，与对照组相比，试验组添加中剂量（106

CFU/g）、

高剂量（107

CFU/g）枯草芽孢杆菌显著降低了盲肠大

肠杆菌数量、未降低回肠大肠杆菌数量。此外，更多

试验显示[14，35-36]

，饲用枯草芽孢杆菌同时显著降低

了盲肠和回肠的大肠杆菌数量。其二，猪饲养试验。

杨阳等[38]

在饲粮中添加枯草芽孢杆菌发现，与对照组

相比，试验组猪盲肠和结肠食糜大肠杆菌数量显

著降低，但对回肠食糜大肠杆菌无显著影响。Guo

等[41]

报道，饲用枯草芽孢杆菌显著降低猪粪便大肠

杆菌数量。然而，更多的猪饲养试验表明，饲用枯

草芽孢杆菌对肠道食糜及粪便大肠杆菌数量无显著

影响[42-44]

。

以上分析提示，除试验动物种类、枯草芽孢杆菌

添加量、取样部位等因素，菌株抑菌作用的巨大差异

可能是影响肠道大肠杆菌调控效果的关键，这显然会

对动物的生产性能产生重要影响。

2.2 枯草芽孢杆菌对沙门氏菌的抑菌作用

表1汇总了8篇枯草芽孢杆菌对沙门氏菌体外抑

菌的 DIZ 数据，参考 Liang等[13]

的抑菌判定标准，分析

如下：①高敏感：8篇文献中的4篇文献[18-20，22]

，包括李

善仁等[20]

报道的两株枯草芽孢杆菌 CS16 和 CS21、卢

冰霞等[22]

发现的菌株 Y1、陈亮等[19]

研究的菌株 B332、

庄国宏等[18]

报道的菌株 GD，均对沙门氏菌属致病菌

有良好的抑制作用；②中敏感：3 篇文献显示[18，20，24]

，

枯草芽孢杆菌对沙门氏菌有一定的抑制作用；③不敏

感：2篇文献显示[29，32]

，多株枯草芽孢杆菌对沙门氏菌

无抑制作用。以上数据表明，不同菌株的枯草芽孢杆

菌对沙门氏菌的抑制作用有显著差异。

大量的肉鸡饲养试验显示（表 2），饲粮中添加

74

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

106

~107

CFU/g 枯草芽孢杆菌显著降低了肉鸡肠道食

糜中沙门氏菌的总菌数[14-15，35]

。然而，邢帅兵等[40]

在

仔猪上的试验却显示，枯草芽孢杆菌对肠道食糜沙门

氏菌数量无显著影响。尽管仔猪试验很少测定肠道

沙门氏菌，但这一结果似乎提示，饲用枯草芽孢杆菌

对沙门氏菌的抑制作用在家禽肠道比生猪肠道的效

果更突出。诚然，这一推测有待于进一步验证。

2.3 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌的抑菌作用

包括产气荚膜梭菌在内的多种致病梭菌诱发动

物坏死性肠炎，其发病率较大肠杆菌、沙门氏菌低，且

隐性病症不易发觉，易被养殖管理者忽视[44-45]

。表 1

汇总了 3 篇枯草芽孢杆菌抑制产气荚膜梭菌的体外

牛津杯试验文献。阳艳林等[33]

研究了7株枯草芽孢杆

菌，结果显示枯草芽孢杆菌 PB6(克洛生)对产气荚膜

枯草芽孢杆菌

菌株编号

KC6

KC5

KC7

KC1

Yak-KC7

Yak-KC5

Yak-KC6

Yak-KC1

GD

WT

POC-4

SF-1

B332

CS16

CS21

CS27

Y33245

Y1

BS-W5

L-NM62

KC-WQ

-

JN-16

-

BS-1

BS-4

BS-6

BS-2

BS-3

BS-5

LV1

LV2

WH1

C3

BS1

PB6

A

B

E

C

D

F

肠道主要有害菌

大肠杆

菌属

25.00

22.00

20.00

17.00

26.00

22.00

20.00

17.00

20.33

17.00

17.33

16.17

17.50

17.80

16.76

12.13

16.50

14.56

14.00

13.00

12.83

12.03

11.46

11.00

9.81

10.47

9.16

0

0

0

0

0

0

0

0

0

沙门氏

菌属

16.00

14.17

14.17

13.33

18.73

17.70

10.07

18.29

0

0

0

猪霍乱

沙门氏菌

13.30

鸡白痢

沙门氏菌

16.80

0

产气

荚膜梭菌

13.45

8.89

10.29

0

0

0

0

22.00

16.00

16.00

12.00

0

0

0

饲料源有害菌

金黄色葡萄球菌

26.00

20.00

20.00

16.00

26.00

24.00

22.00

18.00

20.17

24.83

25.00

25.33

22.73

23.10

24.83

15.00

13.00

10.00

11.40

12.80

12.00

26.00

28.00

10.25

8.00

10.23

商业益生菌

酵母菌

26.50

20.17

24.50

21.50

参考文献

谢晓佩等[16]

王琦等[17]

庄国宏等[18]

陈亮等[19]

李善仁等[20]

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魏姗姗等[27]

Liang等[13]

辛娜等[28]

齐鹏飞等[29]

刘晓燕等[30]

魏可健等[31]

王保华等[32]

阳艳林等[33]

表1 枯草芽孢杆菌体外抑菌作用[牛津杯法，抑菌圈直径DIZ(mm)]

注：1. 抑菌作用判定标准(DIZ)：极敏感，DIZ>20 mm；高敏感，15 mm<DIZ≤20 mm；中敏感，10 mm<DIZ≤15 mm；低敏感，

7.80 mm<DIZ≤10 mm；不敏感，DIZ=7.80 mm；

2.“-”表示枯草芽孢杆菌没设菌株编号。

75

生 物 技 术 2023年第44卷第18期 总第687期

梭菌抑制作用达极敏感，另外2株为高敏感、1株为中

敏感、3 株为不敏感。辛娜等[28]

评估了 6 株枯草芽孢

杆菌，结果显示2株为中敏感、1株为低敏感、3株为不

敏感。魏可健等[31]

证明枯草芽孢杆菌 C3对产气荚膜

梭菌无抑制作用。

上述研究表明，大部分枯草芽孢杆菌无法高效抑

制产气荚膜梭菌，这得到了体内试验的印证(表 2)。

袁文菊等[37]

在肉鸡饲粮中添加 3.0×106

CFU/g 枯草芽

孢杆菌，发现可显著降低盲肠食糜梭菌数量、但无法

降低回肠食糜梭菌数量；而且，他们的另一试验组枯

草芽孢杆菌添加量略微降至1.5×106

CFU/g，则同时无

法降低盲肠和回肠的梭菌数量。Jeong等[15]

在饲粮中

添加更高剂量（3.0×107

CFU/g）枯草芽孢杆菌，无法降

低肉鸡盲肠和回肠的梭菌数量。

3 枯草芽孢杆菌对饲料源有害菌的抑菌作用

金黄色葡萄球菌是饲料源主要致病细菌之一[44]

，

枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑制研究较多，14篇

报道的DIZ数据显示（表1）：①极敏感：14篇文献中的

5篇文献[16-18，20，29]

，包括谢晓佩等[16]

发现 3株枯草芽孢

杆 菌（KC5、KC6、KC7）、王 琦 等[17]

报 道 的 3 个 菌 株

（Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7）、庄国宏等[18]

研究的

4个菌株（GD、WT、POC-4、SF-1）、齐鹏飞等[29]

显示的

菌 株 LV-1 和 LV-2、李 善 仁 等[20]

研 究 的 3 个 菌 株

（CS16、CS21、CS27），均对金黄色葡萄球菌有极强抑

制作用；②高敏感：3 篇文献显示[16-17，21]

，枯草芽孢杆

菌对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用；③中敏感：

8 篇文献显示[22-27，30，32]

，枯草芽孢杆菌对金黄色葡

萄球菌有一定的抑制作用；④低敏感：仅有 1 篇文

献显示[29]

，枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑制作用

偏弱。

以上数据提示，不同菌株的枯草芽孢杆菌对金黄

色葡萄球菌的抑菌作用有显著差异。由于广谱抗生

素能够显著抑制金黄色葡萄球菌[44-45]

，以往饲用抗生

素的应用掩盖了饲料源金黄色葡萄球菌感染肠道的

注：差异幅度（%）=（PD总菌数-BD总菌数）/BD总菌数×100；BD组，基础饲粮组；PD组，枯草芽孢杆菌组；“*”表示统计差

异显著（P<0.05）。

试验动物

AA肉鸡

AA 肉鸡

科宝500猪

白羽肉鸡

淮南松鸡

罗斯308

杜长大(DLY)猪

杜长大(DLY)猪

杜长大(DLY)猪

长×大猪

杜长大(DLY)猪

杜长大(DLY)

枯草芽孢杆菌

添加量(CFU/g)

8.0×105

1.0×106

1.0×106

1.5×106

3.0×106

6.7×106

3.0×107

1.0×105

5.0×105

1.0×107

2.2×105

1.0×106

3.0×107

取样日龄

(d)

21

42

21

42

28

42

35

35

56

35

53

67

70

54

68

7

14

21

29

35

70

取样

(食糜或粪便)

盲肠

盲肠

盲肠

盲肠

盲肠

回肠

盲肠

回肠

盲肠

回肠

盲肠

回肠

盲肠

盲肠

回肠

回肠

盲肠

结肠

回肠

结肠

盲肠

结肠

粪便

粪便

粪便

粪便

肠道及粪便菌数的差异幅度(PD vs BD, %)

大肠杆菌

-69.80

+108.93

-61.10*

-57.34*

-90.88*

-66.89*

-87.98*

-98.90*

-74.30*

-4.50

-80.05*

-10.88

-71.16*

-58.31*

-36.90

-25.87

-25.87*

-42.46*

-5.59

+16.15

-12.90

+20.23

-84.15*

-25.87

-73.70

-12.90

-25.87

+676.25

-56.35

-24.14

沙门氏菌

-64.52*

-65.33*

-66.12*

-62.85*

-48.71*

+12.20

-6.68

梭菌

-43.76

-10.88

-61.09*

-10.88

-16.82

-16.82

乳酸杆菌

+4.17

+488.84*

0

+209.03*

+7.15

+104.17*

+1 849.85*

+175.42*

+5 028.61*

+2 138.72*

+3 448.13*

+1 158.93*

+195.12*

+118.78*

+94.98*

+14.82

+118.78*

+316.87*

+53.82

+110.38*

+336.52

+145.47

+77.83

+336.52*

+2 470.40*

-6.68

+51.36

+1 941.74

-16.82

+34.89

双歧杆菌

+28.83

+4.71

+14.82

+17.49

+65.96*

+19.67

+3.99

+502.56*

+139.88

-80.05

+28.83

-46.29

+263.08

+20.23

参考文献

齐博等[34]

刘凤美等[35]

李佳骏等[36]

袁文菊等[37]

Yang等[14]

Jeong等[15]

杨阳等[38]

Tang等[39]

邢帅兵等[40]

Guo等[41]

倪学勤等[42]

Hu等[43]

表2 饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控作用(菌数检测为平板计数法)

76

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

风险，但当前“禁抗”形式下须重新审视及解决这一问

题。例如，通过体外抑菌试验筛选强效抑制金黄色葡

萄球菌的枯草芽孢杆菌菌株，并应用于养殖生产。

4 枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的抑制作用

众所周知，广谱饲用抗生素抑制乳酸杆菌和双歧

杆菌等肠道有益菌，破坏畜禽肠菌群平衡[44，47]

。然

而，包括枯草芽孢杆菌在内的饲用益生菌对肠道有益

菌的体外抑制作用却鲜有报道[44-47]

。李先磊等[11]

采

用体外混培试验显示，枯草芽孢杆菌HnB-4对乳酸杆

菌HnL-3无抑制作用。相反，李在建等[48]

的体外混培

试 验 表 明 枯 草 芽 孢 杆 菌 对 乳 酸 杆 菌 ( 菌 株 编 号

CICC6075)有显著的抑制作用。以上不同的结果提

示，枯草芽孢杆菌对肠道有益菌可能的抑制作用需重

新认识。

表 2肉鸡饲养试验显示，饲用枯草芽孢杆菌显著

增加肉鸡肠道食糜乳酸杆菌数量，但对双歧杆菌无明

显影响。猪饲养试验显示，饲用枯草芽孢杆菌显著增

加盲肠和结肠食糜乳酸杆菌数量[38，40]

；相反，也有文

献报道饲用枯草芽孢杆菌未显著增加肠道及粪便的

乳酸杆菌数量[42，44]

；此外，枯草芽孢杆菌对猪肠道食

糜及粪便的双歧杆菌无明显影响[42]

。结合上述体外

抑菌试验报道，肠道菌群差异化的表现提示，饲用枯

草芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的影响需进一步明晰。

5 枯草芽孢杆菌对商业饲用益生菌的抑菌作用

当前，我国《饲料添加剂品种目录(2013)》中应用

较为广泛的饲用益生菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢

杆菌、酵母菌、丁酸梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝结芽

孢杆菌等 7种[46]

。饲料禁抗形势下，由于畜禽养殖问

题和需求的多样性，基于不同益生菌差异化的益生性

能，催生了复合饲用益生菌制剂的普遍使用。然而，

课题组前期综述及多个体外抑菌试验均表明，益生菌

之间存在拮抗效应[43，46，49]

。

枯草芽孢杆菌对其他商业益生菌抑制作用的研

究极少（表 1），仅有的一篇报道显示 4 株枯草芽孢杆

菌（菌株编号：SF-1、WT、POC-4、GD）对酵母菌均有

极强的抑制作用，且抑制效果有明显差异[18]

。这一体

外试验结果得到了李玲茜等[6]

动物试验的印证。李玲

茜等[6]

通过鸡饲养试验发现，与单一枯草芽孢杆菌组相

比，组合应用枯草芽孢杆菌和酵母菌组肉鸡的增重、采

食量及料重比均无明显改善。此外，课题组前期体外

抑菌试验[43，46，49]

、动物试验[4-5]

均表明，枯草芽孢杆菌

与凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌之间均存在拮抗效应。

6 小结

基于抑菌性能是饲用枯草芽孢杆菌改善畜禽生

产性能的重要机制之一，建议完善枯草芽孢杆菌体外

抑菌试验的评估方法及相应标准，尤其要重视枯草芽

孢杆菌对肠道有益菌和其他商业益生菌可能的抑制

作用及拮抗效应的评估，这有助于筛选安全的菌株及

高效地研制单一和复合饲用枯草芽孢杆菌制剂，为保

障畜禽生产性能奠定科学基础。

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抑制作用的研究[J]. 饲料博览, 2022(3): 8-12.

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

78

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

近年来，随着我国畜禽养殖规模的扩大，饲料资

源短缺的问题日益严重。玉米豆粕价格的飙升迫使

饲料企业和养殖企业寻求能量饲料和蛋白饲料的替

代品，但棉籽粕、菜籽粕等非常规饲料具有存在抗营

养因子和有毒、有害物质较多的缺点，严重制约畜禽

对其的消化利用。新兴的微生物发酵饲料技术不仅

可以消除或降解大部分抗营养因子和有毒有害物质，

还可以提高可消化养分的含量，这对于提高常规饲料

的利用率和开发非常规饲料原料及促进畜牧业可持

续发展具有非常重要的现实意义。因此，文章综述近

年来国内外关于微生物发酵饲料应用的研究，总结其

种类、对饲料营养价值的影响、在动物生产中的应用

效果及应用替代方案，以期为发酵饲料的开发和利用

提供理论参考。

1 微生物发酵饲料的定义和发酵方式

1.1 微生物发酵饲料的定义

摘 要：微生物发酵饲料与传统饲料相比，具有提升饲料营养价值、改善饲料利用效率、丰富饲

料资源、提高动物生长性能及免疫力，改善动物肠道健康和降低环境污染等优点，因此，在饲料行业

应用前景广阔，且对于畜牧业可持续发展具有重要意义。文章就微生物发酵饲料的特性及其在动物

生产中的应用展开综述，以期为微生物发酵饲料的进一步研究提供理论基础。

关键词：微生物发酵；发酵饲料；营养价值；肠道健康；动物生产

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.012

中图分类号：S816.6 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0079-07

Research Progress on Characteristics of Microbial Fermented Feed and Its Application in

Animal Production

ZHANG Guanfeng1

ZENG Wenlin2

ZHENG Mengli1

CHEN Qinghua1*

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410125,

China; 2. Lengshuijiang Livestock, Fisheries and Agricultural Machinery Affairs Center, Hunan Loudi

417500, China)

Abstract：Compared with traditional feed, microbial fermented feed has the advantages of improving feed

nutritional value, improving feed utilization efficiency, enriching feed resources, improving animal growth

performance, immunity, improving animal intestinal health and reducing environmental pollution. There⁃

fore, it has a broad prospect of application in the feed industry and is of great significance for the sustain⁃

able development of animal husbandry. In this paper, the characteristics of microbial fermentation feed

and its application in animal production were reviewed, so as to provide a theoretical basis for further re⁃

search on microbial fermentation feed.

Key words：microbial fermentation; fermentation feed; nutritive value; intestinal health; animal produc⁃

tion

微生物发酵饲料的特性及其在动物生产中

的应用研究进展

■ 张关锋1 曾文林2 郑梦莉1 陈清华1*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410125；2.冷水江市畜牧水产和农机事务中心，湖南娄底 417500）

作者简介：张关锋，硕士，研究方向为饲料资源开发利用。

*通讯作者：陈清华，教授，博士生导师。

收稿日期：2023-05-17

基金项目：湖南省“双一流”建设专项[kxk201801004]

79

生 物 技 术 2023年第44卷第18期 总第687期

微生物发酵饲料是指在人为控制条件下，将一些

抗营养因子含量高、利用率低、适口性较差的植物性

农副产品为主要原料（底物），通过微生物发酵将部分

纤维素、蛋白质和脂肪等大分子营养物质降解成易被

动物吸收的糖类和可溶性小肽及有机酸等小分子物

质，从而制成营养丰富、适口性好及有益微生物含量

较高的一类生物饲料[1]

。

1.2 微生物发酵饲料的方式

微生物发酵饲料按照发酵工艺分为固态发酵和

液态发酵，固态发酵是指在微生物生长的培养基中无

可以流动的游离水且发酵物质来源广泛，具有发酵终

产物浓度较高、易于保存、发酵过程产生的废水较少

等特点；液态发酵是指在生化反应器中，通过人工方

式将菌株生长所需要的糖、氮盐以及无机盐等营养物

质全部溶于水中作为培养基，灭菌后进行接种，液体

发酵具有原料来源广泛、菌体生长快速、生产周期短

等特点[2]

。

目前在饲料行业生产中固、液态发酵均可用于有

机酸、酶制剂、维生素、肽类和其他生长因子等饲料添

加剂的工业化生产，但根据两种发酵方式的特点，液

态发酵更利于规模化生产，固态发酵则在改变常规、

非常规饲料原料的特性和利用工业残渣或副产物生

产单细胞蛋白质饲料方面应用更为广泛。两种发酵

模式在受限因素方面，液态发酵存在发酵设备庞大、

耗能高和费用大等弊端，固态发酵存在生产机械化程

度低、发酵产品稳定性差和发酵过程难以控制工艺参

数（如温度、pH、营养成分等）等劣势[3]

。

1.3 微生物发酵的菌种

目前，发酵常用菌剂多为复合菌，包括芽孢杆菌

（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等）；乳

酸菌（植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等）；酵母

菌（产朊假丝酵母、酿酒酵母）和霉菌（米曲霉、毛霉、

根霉等）[4]

，以及这些菌种之间按照不同比例的组合。

1.4 微生物发酵饲料的原料

微生物发酵饲料的原料可以分为常规饲料原料

和非常规饲料原料，常规饲料原料是指一些常见的、

利用价值高、易于消化和吸收的一类饲料原料（如玉

米、大豆、小麦等）；而非常规饲料原料是指一些存在

营养价值较低、抗营养因子含量高、成分复杂或不稳

定而又缺乏营养价值评定标准等问题的饲料原料，大

致可分为饼粕类、糟渣类、秸秆秕壳3类[5]

。

2 微生物发酵饲料的特性

2.1 提高饲料营养物质含量、降低抗营养因子含量

在微生物发酵过程中，针对不同类型的饲料原料

可以使用不同的菌种进行发酵。发酵常规饲料方面，

Zhang 等[6]

研究表明，利用枯草芽孢杆菌固态发酵豆

粕，发酵后豆粕中的大分子糖和蛋白质被降解为有机

酸、小肽、游离氨基酸等，其中必需氨基酸总量增加了

12.2%，非必需氨基酸总量增加了 10.8%，游离氨基酸

总量是未发酵组的 12.76倍。Zheng 等[7]

研究表明，通

过芽孢杆菌固态发酵豆粕可以显著降低豆粕中抗营

养因子的含量。Jiang 等[8]

利用枯草芽孢杆菌（CICC

10262）和嗜酸乳杆菌（ACCC 10637）混合固态发酵玉

米蛋白粉，结果显示发酵后中性洗涤纤维含量显著降

低，粗蛋白、氨基酸和小肽含量显著升高。发酵非常

规饲料方面，Wang等[9]

使用由地衣芽孢杆菌(1.0813)、

酵母菌(ACCC20060)和乳酸菌(ACCC10637)组合成的

复合益生菌固态发酵菜籽粕，发酵后可溶性蛋白含

量、乳酸含量和总氨基酸含量显著增加，硫苷和中性

洗涤纤维含量显著降低。Wang等[10]

利用乳酸菌菌株

固态发酵棉籽粕，结果显示，发酵后棉粕中粗蛋白和

必需氨基酸的含量极显著增加，棉酚降解率达 83%。

有研究报道，淀粉芽孢杆菌 NX-2S固态发酵豆渣，使

豆渣中胰蛋白酶抑制剂、植酸和单宁等抗营养因子分

别降低了 98.7%、97.8% 和 63.2%[11]

。此外，有研究表

明，通过桦褐孔菌固态发酵麦秸，发酵后显著提高了

麦秸中粗蛋白含量和必需氨基酸中蛋氨酸、赖氨酸的

含量[12]

。Wang 等[13]

使用 4 种白色腐真菌（红腐霉

CGMCC 5.600、杏鲍菇 CGMCC 5.732、凤尾菇 CGMCC

5.592和金顶侧耳 CGMCC 5.244）固态发酵玉米秸秆，

结果显示，发酵后 4种白色腐真菌均显著提高了玉米

秸秆中粗蛋白含量，同时降低了中性洗涤纤维、酸性

洗涤纤维、半纤维素和纤维素的含量。

由此可见，针对饲料的特性以及改善效果，选择

相应的微生物发酵处理可提高饲料营养成分的含量，

降低抗营养因子及有毒、有害物质的含量，从而提高

饲料中可消化营养物质的含量[14]

。在微生物发酵饲

料的过程中，还需考虑不同菌种之间的协同和拮抗作

用。一般情况下，混合菌种的发酵效果要优于单一菌

种，不同菌种分步发酵效果优于混合发酵，且混菌分

步发酵效果优于单菌发酵和混菌同步发酵[15-16]

。

2.2 降低饲料毒性和抑制有害菌产生

微生物通过固态发酵的方式发酵饲料还可以降

低饲料中毒素的含量、抑制有害菌的生长，尤其在饼

粕类等非常规饲料中效果显著（见表1）。

2.3 提高饲料中抗氧化成分含量

80

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

经微生物发酵后的饲料原料会产生植物肽类[22]

、

酚类和黄酮[23]

等抗炎、抗氧化物质。研究表明，利用枯

草芽孢杆菌和米曲霉固态分步发酵豆粕，显著提高了豆

粕总酚化合物浓度和体外抗氧化活性[24]

。Jiang等[25]

通

过枯草芽孢杆菌MTCC5480固态发酵玉米蛋白粉，结果

显示，36 ℃时发酵后玉米肽的浓度达到最大值，此外，还

通过D-半乳糖诱导衰老大鼠试验验证了发酵所产生

玉米肽具有良好的抗氧化能力，可作为天然抗氧化剂，

这也表明了发酵所产生的玉米肽具有安全性和可靠

性。凌阿静等[26]

使用真菌发酵麦麸，结果显示，黑曲霉

菌、米曲霉菌和里氏木霉菌 3种菌均能显著增加麦麸

中总游离酚含量、阿魏酸含量及抗氧化活性；其中，米

曲霉菌发酵麦麸效果最好，可以得出结论：米曲霉菌是

降解麦麸生产阿魏酸、提高麦麸抗氧化活性的优良菌

种。阿魏酸是一种自由基清除剂，具有抗炎、抗氧化、抗

菌活性等生理功能[27]

。Wang 等[28]

通过枯草芽孢杆菌

YY-4和植物乳杆菌CICC6026混合固态发酵菜籽粕，

发酵后小分子肽浓度极显著增加，表现出高可用性、抗

氧化活性和免疫调节活性。Karakurt等[29]

利用枯草芽

孢杆菌ATCC 6633固态发酵葵花籽粕，发酵后总酚含

量和抗氧化活性显著增加。此外，Xu等[30]

研究表明可

以通过桦褐孔菌发酵小麦、水稻秸秆和甘蔗渣生产抗氧

化活性胞外多糖，从而提高发酵产物的抗氧化能力。由

此可见，不同的饲料原料经微生物发酵后可以产生不同

的抗氧化物质，从而提高饲料中抗氧化成分的含量。

2.4 改善饲料风味、提高饲料适口性

有研究表明饲料的风味[31]

和适口性[32]

可直接促

进动物进行采食行为，是影响动物的采食量的主要因

素。在发酵的过程中，会产生芳香族化合物等，改善

饲料风味，提高适口性[33]

。韩翠萍等[34]

研究表明，经

植物乳杆菌和酿酒酵母菌复配发酵的玉米粉可明显

提高芳烃化合物、氮氧化合物和醇类物质的挥发；同

时，由于两种菌种之间产生的协同作用，发酵过程中

会产生更多有机酸、多糖和酶等物质，使玉米粉带有

淡淡水果香气。吴正可等[35]

使用嗜酸乳杆菌、枯草芽

孢杆菌和酿酒酵母菌固态发酵菜籽粕，发酵后的菜籽

粕呈蓬松状，颜色为黄褐色，有浓郁的酸香味。Liu

等[36]

用乳酸菌发酵液吸附和发酵稻草饲料，发酵后的

稻草饲料不仅具有独特的酸香味，适口性也得到了改

善。Jiang等[37]

用毛木耳菌株固态发酵麦麸纤维，通过

气相色谱-质谱分析，毛木耳菌能降解麦麸纤维并产

生多种芳香化合物。综上，无论是常规饲料原料还是

非常规饲料原料，经微生物发酵后其形态、颜色、气

味、适口性等多方面都会得到很大程度改善，从而可

提高饲料的饲用价值。

3 微生物发酵饲料在畜牧生产中的应用

3.1 在猪生产中的应用

微生物发酵饲料可应用于断奶仔猪、母猪、育肥

猪的各个阶段，且在不同阶段的应用效果也有所不

同。由于断奶仔猪本身分泌的消化酶含量不足且酶

活性较低，而断奶仔猪日粮中蛋白质含量较高，所以

容易发生营养性腹泻[38]

，另外，断奶应激造成仔猪的

肠道菌群失调和抗氧化能力降低也会导致仔猪发生

腹泻[39]

，使仔猪生产效率大大降低。而微生物发酵饲

料应用于断奶仔猪日粮中可促进仔猪肠道健康、提高

抗氧化能力，从而减少断奶仔猪腹泻，提高生长性能。

此外，微生物发酵饲料应用于母猪日粮中可以提高母

猪免疫力和繁殖性能，应用于育肥猪日粮中可以提高

育肥猪的生长性能、降低饲料成本和提高猪肉品质等

（见表2）。微生物发酵饲料在猪生产中等比例替代基

础日粮中某一原料或部分营养成分的范围为 4%~

25%，若发酵非常规饲料作为猪的基础日粮替代方

案，则以6%左右的等比例替代效果最好。

3.2 在禽生产中的应用

微生物发酵饲料在禽生产中主要应用于肉鸡、蛋

鸡、肉鸭和蛋鸭日粮中，其中在肉鸡、肉鸭生产中应

饲料类型

棉籽粕、菜粕

花生粕

菜籽粕

玉米青贮、

玉米籽粒

棉籽粕

菌种

乳酸菌、酵母菌

鲁氏酵母菌

酱油曲霉、丝状曲霉

芽孢杆菌、酵母菌

戊糖片球菌

发酵方式

固态发酵

固态发酵

固态发酵

固态发酵

固态发酵

试验效果

游离棉酚和芥子油苷浓度显著降低

黄曲霉毒素B1的脱毒率达到了97.52%

显著降低了植酸和总硫代葡萄糖苷的含量

全株玉米青贮中黄曲霉毒素B1和呕吐毒素最高

脱毒率分别可达48.61%和59.23%；玉米籽粒中

黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮最高

脱毒率分别可达67.59%、73.03%和65.71%

游离棉酚和结合棉酚的清除率为87.15%和

22.83%，且发酵菌株对大肠杆菌、金黄色

葡萄球菌具有抑制作用

参考文献

Yusuf等[17]

Zhou等[18]

Olukomaiya等[19]

石楠[20]

张琛等[21]

表1 微生物发酵降低饲料毒性和抑制有害菌相关研究报道

81

生 物 技 术 2023年第44卷第18期 总第687期

用，可以提高其生长性能、抗氧化能力和肠道健康，还

可以改善肉品质；应用于蛋鸡、蛋鸭生产中可以提高

肠胃健康、蛋品质、机体免疫力和降低料蛋比等（见

表 3）。微生物发酵饲料在禽类日粮中等比例替代某

一原料或部分营养成分的范围为4%~10%左右，其中

以6%左右的等比例替代效果最好。

试验动物

仔猪

仔猪

母猪

母猪

育肥猪

育肥猪

发酵饲料替代类型

发酵豆粕替代豆粕

发酵棉粕替代豆粕

发酵豆粕替代豆粕

发酵大豆皮替代大豆皮

发酵棉粕替代豆粕

或未发酵棉粕

发酵玉米秸秆替代

基础日粮

替代量(%)

25

6

4、6

6

10

6

试验效果

通过增强仔猪肠道上皮屏障功能，抑制促炎因子表达，

从而减少了仔猪腹泻，提高了仔猪的生长性能

显著降低了仔猪腹泻率、显著提高了仔猪的生长性能、

抗氧化能力以及回肠和盲肠有益微生物的相对丰度

试验组均提高了母猪血清抗氧化水平和仔猪出生后

第14、21天的平均体重；4%发酵豆粕组提高了初乳中

蛋白质和免疫球蛋白G水平和泌乳第17天血清中

超氧化物歧化酶活性；6%发酵豆粕组提高了血清中

雌激素和生长因子水平

改善了母猪血浆生化指标和激素含量，提高了母猪血浆

免疫球蛋白含量和繁殖性能（提高仔猪初生窝重、

窝健仔数，缩短母猪产程等）

发酵棉粕组与豆粕组差异不显著，但相较于未发酵棉粕

组，提高了育肥猪生长性能和对营养物质的消化率

6%试验组提高了育肥猪的生产性能、眼肌面积、肌肉

pH，降低了肌肉滴水损失率以及饲料成本

参考文献

Wang等[40]

Gu等[41]

Luo等[42]

崔英杰等[43]

Shi等[44]

杨海天等[45]

表2 微生物发酵饲料在猪生产中的应用

试验动物

肉鸡

肉鸡

肉鸡

肉鸭

蛋鸡

蛋鸭

发酵饲料替代类型

发酵豆粕替代豆粕

发酵菜籽粕替代豆粕

发酵罗汉果渣替代玉米

木薯生物乙醇废弃物

替代玉米、豆粕和麸皮

发酵玉米、豆粕混合

饲料替代玉米豆粕

发酵酒糟替代麦麸

替代量(%)

6

10

5.91~6.66

5

≥6

4

试验效果

通过提高肉鸡对蛋白质、脂质代谢能力，从而

提高了肉鸡的生长性能

显著提高了肉鸡血清SOD含量、总抗氧化能力

和十二指肠绒毛高度

通过降低血清尿素氮含量、腿肌蒸煮损失和

提高胸肌红度值，从而改善了肉鸡的血清生化

指标和肉品质

提高了肉鸭的生长性能和胴体性能

显著降低了蛋鸡十二指肠和空肠隐窝深度，提高

了绒毛高度；通过显著提高空肠分泌型免疫球

蛋白A的含量和MUC2 mRNA的表达量，

从而提高蛋鸡机体免疫力

显著提高了蛋鸭的日产蛋重、蛋黄颜色和空肠

脂肪酶、糜蛋白酶活性等肠道消化酶活性；

显著降低了料蛋比、蛋鸭肌胃、腺胃pH

参考文献

Sembratowicz

等[46]

Wu等[47]

梁丽芬等[48]

Lei等[49]

Liu等[50]

阮栋等[51]

表3 微生物发酵饲料在禽生产中的应用

3.3 在反刍动物中的应用

微生物发酵饲料在反刍动物生产中主要应用于

肉牛、奶牛、肉羊和奶山羊日粮中[52]

，其中在肉牛、肉

羊生产中应用可以提高其生长性能、屠宰性能、肉品

质、对于营养物质的消化率和提高瘤胃优势菌的相对

丰度从而稳定瘤胃内环境；在奶牛、奶山羊生产中应

用可以提高其瘤胃发酵功能、泌乳性能和降低饲料成

本等（见表4）。与单胃动物不同的是反刍动物日粮中

粗饲料的比例较高，其他原料成分占总日粮比例相对

较低，所以微生物发酵饲料等比例替代某一原料或部

分营养成分的范围为 10%~100%，但具体替代量要根

据所替代发酵饲料原料的种类进行调整。

3.4 在水产动物中的应用

在水产动物日粮中因鱼粉相较于其他饲料原料

具有蛋白质含量高、易消化吸收等特点，所以使用比

例较大，而微生物发酵饲料具有营养丰富、抗营养因

子含量低、抗氧化成分含量高等特点，且价格相比鱼

粉有较大优势，常用于一定比例替代鱼粉[58]

。微生物

82

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

发酵饲料替代鱼粉可以提高鱼虾的生长性能、消化功

能、抗氧化能力和改善肠道健康，并且可以降低饲料

成本（见表 5），且在水产动物日粮中等比例替代鱼粉

的范围在25%~50%。

试验动物

肉牛

羔羊

奶牛

奶牛

奶山羊

发酵饲料替代类

发酵玉米秸秆替代青贮

玉米秸秆

发酵TMR＋菜籽粕、棉粕

替代发酵TMR+豆粕

玉米、麸皮混合物

替代豆粕

DDGS替代玉米、

膨化豆粕

杂交构树发酵饲料

替代苜蓿干草

替代量(%)

40

100

50、100

18

10

试验效果

通过显著提高肉牛瘤胃中普雷沃氏菌属的丰度，

从而促进了瘤胃微生态系统的稳定

发酵菜籽粕组提高了羔羊肉质中饱和脂肪酸的

含量，发酵棉粕组显著提高了羔羊瘤胃液总挥发

性脂肪酸含量和肉质中不饱和脂肪酸的含量

提高了奶牛的泌乳性能、瘤胃发酵能力和对于

营养物质的消化率

在降低饲料总成本的同时，并不影响泌乳奶牛

的生产性能

提高了奶山羊的泌乳性能、改善了羊奶品质

参考文献

Guo等[53]

Yusuf等[54]

Jiang等[55]

Ranathunga等[56]

王智[57]

表4 微生物发酵饲料在反刍动物中的应用

试验动物

非洲鲶鱼

真鲷

凡纳滨对虾

凡纳滨对虾

发酵饲料替代类型

发酵豆粕替代鱼粉

发酵菜籽粕替代鱼粉

发酵豆粕替代鱼粉

发酵棉粕替代鱼粉

替代量(%)

40

25、50

40

50

试验效果

显著提高了非洲鲶鱼的生长性能和肠道中优势菌（嗜黏

蛋白阿克曼菌，Akkermansia muciniphila）的相对丰度

25%的鱼粉替代提高了真鲷的生长性能和抗氧化能力，

50%的鱼粉替代在降低饲料成本的同时，并不影响真鲷

的生长性能和对于营养物质的吸收率

提高了凡纳滨对虾的生长性能和SOD活性

发酵棉籽粕可替代高达50%的鱼粉，且不影响凡纳滨

对虾生长和对饲料的利用

参考文献

Zakaria

等[59]

Dossou等[60]

Bae等[61]

Sun等[62]

表5 微生物发酵饲料在水产动物中的应用

4 小结

常规和非常规饲料经微生物发酵后，可降低原料

中的抗营养因子、有毒有害物质含量，提高饲料中抗

氧化物质的含量并改善饲料的适口性。同时，微生物

发酵饲料可改善动物的生长性能、调节肠道菌群平

衡、提高动物免疫力和改善肉品质等。但在生产实践

中，微生物发酵饲料技术仍然存在很多局限性（如发

酵菌种稳定性不足）；菌种代谢产物的成分和作用机

制尚不清楚；不同饲料原料与菌种之间以及不同菌种

之间的组合作用研究尚浅；部分发酵工厂生产的工艺

水平和设备相对落后等。未来微生物发酵饲料要充

分利用生物工程技术，筛选出耐受能力强、表达量高的

优良菌种；加大对于菌种作用机制的研究；不断优化发

酵工艺提高发酵产品质量，从而节约饲料资源、降低饲

养成本、减少环境污染，促进畜牧业可持续发展。

参考文献

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（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

85

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

桑叶1-脱氧野尻霉素对新西兰白兔生长性能、

肉品质和抗氧化性能的影响

■ 李少璁 侯文玉 王一凡 李士玟 张慧玲 侯启瑞 赵卫国*

（江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江 212100）

作者简介：李少璁，硕士，研究方向为动物营养与调控。

*通讯作者：赵卫国，研究员，博士生导师。

收稿日期：2023-05-17

基金项目：科技部科技伙伴计划资助[KY202201002]；国

家蚕桑产业技术体系项目[CARS-18]；国家重点研发计划项

目[2021YFE0111100]；镇江市科技计划项目[GJ2021015]；农业

农村部作物种质资源保护项目[111721301354052026]；国家

科技部种质资源平台项目[NICGR-43]；江苏省研究生科研与

实践创新计划项目[SJCX21_1799]

摘 要：试验旨在研究正常桑叶饲喂量下1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin, DNJ）对新西兰白

兔生长性能、养分表观消化率、肉品质、肌肉脂肪酸组成和抗氧化性能的影响。选取36只45日龄体重相

近（[ 1.05±0.04） kg]的新西兰白兔按饲粮中 DNJ添加量（0、0.14、0.28 g/kg）随机分为对照组、L-DNJ组

和H-DNJ组，每组12个重复，每个重复1只。预试期14 d，正试期28 d。结果表明：①与对照组相比，

H-DNJ组兔平均体重、干物质和粗脂肪表观消化率显著降低（P<0.05），粗蛋白表观消化率显著增高

（P<0.05）；②与对照组相比，处理组兔肉红度a*

显著提高（P<0.05），粗脂肪含量显著降低（P<0.05），HDNJ组兔肉亮度L*

显著降低（P<0.05）；③各组兔肉中棕榈酸（16 ：0）和亚油酸（C18 ：2n6c）含量最高，其

次为油酸（18 ：1n9）和硬脂酸（18 ：0），H-DNJ组兔肉中饱和脂肪酸（SFA）含量显著降低（P<0.05），多

不饱和脂肪酸（PUFA）含量显著提高（P<0.05）；④处理组兔中肉谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性

显著提高（P<0.05），H-DNJ组总抗氧化能力（T-AOC）显著提高（P<0.05）。综上所述，桑叶DNJ能够降

低新西兰白兔对干物质和粗脂肪表观消化率，提高对粗蛋白表观消化率，影响生长性能。但适量添加

可以改善兔肉质量，提高兔肉中PUFA含量和抗氧化能力，使其更有益人类健康并利于保存。

关键词：兔；桑叶；1-脱氧野尻霉素；肉品质；脂肪酸；抗氧化

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.013

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0086-07

Effects of Mulberry Leaf 1-Deoxynojirimycin on Growth Performance, Meat Quality and

Antioxidant Properties of New Zealand White Rabbits

LI Shaocong HOU Wenyu WANG Yifan LI Shiwen ZHANG Huiling HOU Qirui ZHAO Weiguo*

(School of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology, Jiangsu Zhenjiang 212100, China)

Abstract：The aim of this experiment was to investigate the effects of 1-deoxynojirimycin (DNJ) on

growth performance, apparent nutrient digestibility, meat quality, muscle fatty acid composition and anti⁃

oxidant properties of New Zealand White rabbits at normal mulberry leaf feeding levels. Thirty-six New

Zealand White rabbits of similar body weight [(1.05±0.04) kg] at 45 days of age were randomly divided

into control, L-DNJ and H-DNJ groups according to the amount of DNJ added to the diet (0, 0.14, 0.28

g/kg), with 12 replicates in each group. The pre⁃

test period was 14 d and the positive test period

was 28 d. The results showed that compared with

the control group: ① the mean body weight, ap⁃

parent digestibility of dry matter and crude fat

were significantly lower and apparent digestibility

of crude protein was increased in the H-DNJ

group (P<0.05). ② The redness of rabbit meat a*

was significantly higher and crude fat content was

significantly lower in the treated group (P<0.05),

and the brightness of rabbit meat L*

was signifi⁃

86

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

桑 树（Morus alba）的 叶 子 具 有 较 高 的 营 养 价

值，被称为“天然的植物营养库”，主要营养成分高

于一般牧草，消化率达 80%~95%，是一种理想的动

物饲料资源。研究显示，桑叶可以改善动物生长性

能和畜产品品质，提高机体免疫功能和抗氧化能

力。但桑叶添加量过高时则会影响饲粮养分的消

化，从而降低动物的采食量和生长性能[1-2]

。Hou 等[3]

研究认为，桑叶添加量不能过高可能与其含有较多

的酚酸、黄酮和生物碱等生物活性物质有关。1-脱

氧野尻霉素（DNJ）是桑树中高度富集的一种多羟基

哌啶生物碱，在桑叶中含量最高可达 0.791 1%[4]

。现

代药理研究证明，DNJ 对小肠中的 α-葡糖苷酶活性

具有强竞争性抑制，能够降低人体空腹血糖和餐后

血糖峰值，降低与脂代谢相关的酶活性，减少脂肪

酸受体蛋白 CD36 和脂肪合成转录因子 C/EBP α 的

mRNA 表达量，因此具有降血糖、降血脂的功效[5]

。

另外，桑叶 DNJ 还具有抗菌、抗氧化和抑制癌细胞

生长等作用[6]

。由于 DNJ 在桑叶中含量较高，动物

采食桑叶的同时也增加了 DNJ 的摄入量，因此，近

年已有学者开始关注其对动物营养代谢和畜产品

品质的影响[7-8]

。

本课题组前期研究了日粮添加0.4 g/kg和2.0 g/kg

DNJ对新西兰白兔生长性能、屠宰性能和肉品质的影

响[9]

，以桑叶 DNJ 平均含量 0.26% 计算[4]

，相当于兔

日粮添加桑叶15%和75%，远高于桑叶的正常使用量

（≤10%）[10]

，不能反映桑叶正常饲喂量下 DNJ的作用。

因此，本试验设定日粮中DNJ的添加量为0.14 g/kg 和

0.28 g/kg，相当于添加桑叶 5.4% 和 10.8%，以研究正

常桑叶饲喂量下DNJ对动物生长性能、养分表观消化

率、肉品质、肌肉脂肪酸组成和抗氧化性能的影响，为

科学利用桑叶饲料资源提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桑叶 DNJ 购自上海中药对照品实验耗材中心，

HPLC 检测 DNJ 含量 ≥ 98%；新西兰白兔来自江苏省

农业科学院实验兔场。

1.2 试验方法

采用单因素完全随机试验设计。选取36只45日

龄平均体重为（1.05±0.04） kg的健康新西兰白兔（公）

随机分为 3 组，每组 12 个重复，每个重复 1 只。对照

组饲喂基础饲粮，L-DNJ 组饲喂基础饲粮+0.14 g/kg

DNJ，H-DNJ 组饲喂基础饲粮+0.28 g/kg DNJ。基础

饲粮组成及营养水平见表1。饲粮混合均匀后制备成

直径6 mm、长1 cm的圆柱形颗粒。预试期14 d，正试

期28 d。

试验前，对兔舍和兔笼进行清洁消毒，按照常规

程序免疫，兔舍自然通风和光照。试验兔单笼饲养，

每天定时饲喂、补水各两次（08：00、17：00），自由采食

和饮水。

1.3 测定指标与检测方法

1.3.1 生长性能

正试期第1天和试验结束第2天早上对试验兔空

腹称重 1次，并计算每只兔的平均日增重（ADG）。每

日饲喂前清理收集剩料并称重，并计算每只兔的平均

日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

ADG（g）=（末期体重-初始体重）/试验天数

cantly lower in the H-DNJ group (P<0.05). was significantly lower (P<0.05). ③ The highest palmitic ac⁃

id (16 ：0) and linoleic acid (C18 ：2n6c) contents, followed by oleic acid (18 ：1n9) and stearic acid

(18 ：0) were found in rabbit meat of all groups, and the saturated fatty acid (SFA) content was signifi⁃

cantly lower (P<0.001) and polyunsaturated fatty acid (PUFA) content was significantly higher in rabbit

meat of the H-DNJ group (P< 0.05). ④Meat glutathione peroxidase (GSH-Px) activity was significantly

increased (P<0.05) in the treated rabbits, and total antioxidant capacity (T-AOC) was significantly in⁃

creased (P<0.05) in the H-DNJ group. In conclusion, Mulberry leaf DNJ was able to reduce the apparent

digestibility of dry matter and crude fat and increase the apparent digestibility of crude protein in New

Zealand white rabbits, affecting growth performance. However, moderate addition could improve the quali⁃

ty of rabbit meat, increase the PUFA content and antioxidant capacity in rabbit meat, making it more

beneficial for human health and preservation.

Key words：rabbit; mulberry leaf;1-deoxynojirimycin; meat quality; fatty acids; ant-oxidation

87

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

ADFI（g）=总采食量/试验天数

F/G=ADFI/ADG

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

原料组成

苜蓿草粉

玉米

豆粕

麸皮

统糠

大豆油

磷酸氢钙

石粉

食盐

L-赖氨酸

DL-蛋氨酸

预混料

合计

含量(%)

16.09

21.41

15.34

22.32

18.03

3.01

0.40

1.50

0.50

0.10

0.30

1.00

100.00

营养水平

消化能(DE，MJ/kg)

粗蛋白(CP，%)

粗纤维(CF，%)

中性洗涤纤维(NDF，%)

酸性洗涤纤维(ADF，%)

酸性洗涤木质素(ADL，%)

粗脂肪(EE，%)

粗灰分(Ash，%)

钙(Ca，%)

总磷(TP，%)

赖氨酸(%)

蛋氨酸+胱氨酸(%)

11.23

17.91

14.86

32.82

20.47

7.08

3.39

7.67

1.05

0.51

0.88

0.68

注：1. 预混料为每千克饲粮提供：Fe 30 mg、Cu 6 mg、Zn 35 mg、

Mn 8 mg、Se 0.05 mg、Co 0.3 mg、I 0.4 mg、VA 6 000 IU、VD

900 IU、VE 15 IU、VK3 1 mg、生物素 100 μg、胆碱 100 mg、

吡哆醇 0.5 mg、核黄素 3 mg、VB12 9 μg、烟酸 35 mg、泛酸

8 mg；

2. 消化能为计算值，其余营养水平均为实测值。

1.3.2 养分表观消化率

于试验第 14 天每组随机挑选 8 只体重相近的试

验兔转移至代谢笼中进行消化代谢试验。消化代谢

试验采用全收粪法，连续 3 d 收集试验兔的全部粪

样，并参照张丽英[11]

方法测定饲粮和粪样中各养分

含量。

某养分表观消化率（%）=（饲粮中该养分含量-粪

中该养分含量）/饲粮中该养分含量×100。

1.3.3 肉品质

试验结束当天晚上禁食（不禁水），第2天早上称

重后每组选体重相近的 8 只试验兔屠宰。采集兔的

背 最 长 肌 ，用 具 有 自 动 温 度 补 偿 功 能 的 pH 计

（Bante221，上海班特仪器有限公司）在背最长肌的

前、中、后三个部位测量 pH（pH45 min），室温放置 24 h

后 再 次 测 定（pH24 h），计 算 24 h 肌 肉 pH 下 降 值

（pH24 h下降）。pH 为 3 次读数的平均值。肉色[亮度

（L*），红度（a*），黄度（b*）]使用TC-PⅡG自动色差计

（北京奥依克光电仪器有限公司）在肌肉表面进行检

测，根据 CIE 实验室标准检测光源为 D65，8 mm 直径

测量面积，在每个检测点测量3次取平均值。

称取肉样约 20 g（记为 M1）用细线吊起，外套塑

料袋，袋口系紧，内留足够空间接纳肉样渗出的水滴，

悬挂于 4 ℃冰箱 24 h。取出后用吸水纸吸取表面水

分后称重（记为M2）。每只兔子测3个平行样，结果取

平均值。

滴水损失（%）=（M1-M2）/M1×100

另取肉样修剪成 1 cm×1 cm×2.5 cm 的肉条，用

TMS-PRO质构仪（美国FTC公司）以垂直于肌纤维的

方向测定剪切力，测量3次，结果取平均值。

肌肉中水分、粗蛋白和粗脂肪含量按照张丽

英[11]

方法进行检测。

1.3.4 肌肉脂肪酸组成

取 10 g 肉样粉碎，冷冻干燥后提取总脂肪，并使

用三氟化硼、己烷和甲醇混合物[35 ：20 ：45（v/v/v）]

将其转化为脂肪酸甲酯，然后用配有 60 m×0.25 mm×

0.25 μm 毛细管柱的气相色谱质谱联用仪 GC/MS（型

号7890-5975，安捷伦科技公司）测定脂肪酸组成和含

量。气相色谱条件设置为：进样器温度 220 ℃，检测

器温度 275 ℃；初始柱室温度为 140 ℃保持 5 min，

然后以 4 ℃/min 的速度提高到 240 ℃，在 240 ℃保持

15 min。最后，用火焰电离检测器测定脂肪酸。电离能

为70 eV，离子源温度为200 ℃，扫描范围50~500 m/z。

将色谱图中各峰的保留时间与 37种脂肪酸甲酯混合

标准品（B25881，上海源业生物技术有限公司）的保留

时间进行比较，确定各峰的性质。每个样品测量三

次，取平均值。

1.3.5 肌肉抗氧化性能

取肌肉组织约 5 g，在 0~4 ℃预冷的生理盐水中

漂洗，除去血液，用滤纸拭干后称重。按 9 ：1的比例

将肌肉组织与 0~4 ℃预冷的匀浆缓冲液在冰水浴中

充分混合匀浆，制成 10% 质量浓度的肌肉组织匀浆

液。匀浆缓冲液含 0.01 mol/L 蔗糖、0.14 mol/L NaCl、

0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L Na2EDTA，pH 7.4。

用试剂盒检测组织悬液的总蛋白含量和丙二醛

（MDA）含量，检测方法为比色法。在测定总抗氧化能

力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧

化物酶（GSH-Px）活性前将匀浆悬液3 000 r/min离心

15 min，取上清使用有关试剂盒测定酶活性。试剂盒

均来自南京建成生物工程研究所有限公司，操作方法

遵循试剂盒说明书。

1.4 数据统计与分析

试验数据先用 Microsoft Excel 初步处理，然后用

SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析和显著性检验。

Duncan’s 法进行多重比较，以 P<0.05 作为差异显著

88

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

性判断标准。根据以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 桑叶DNJ对兔生长性能的影响

从表 2 可以看出，与对照组相比，其余两组新西

兰白兔平均日采食量和料重比有降低的趋势，但未达

到显著水平（P>0.05）。H-DNJ 组兔平均日增重显著

低于对照组（P<0.05）。

2.2 桑叶DNJ对兔养分表观消化率的影响

如表 3 所示，与对照组相比，H-DNJ 组兔对干物

质和粗脂肪的表观消化率显著降低（P<0.05），对粗蛋

白的表观消化率显著提高（P<0.05）；各处理组间兔对

粗灰分、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表

观消化率无显著影响（P>0.05）。

表2 桑叶DNJ对新西兰白兔生长性能的影响

项目

ADFI(g)

ADG(g)

F/G

对照组

146.24

40.13a

3.61

L-DNJ组

145.33

36.38ab

3.48

H-DNJ组

140.46

33.83b

3.41

标准误

0.56

0.22

0.11

P值

0.073

0.016

0.489

注：同行数据肩标含有相同字母或无字母表示差异不显著（P>

0.05），不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05）；下表同。

项目

干物质(DM)

粗蛋白(CP)

粗脂肪(EE)

粗灰分(Ash)

粗纤维(CF)

中性洗涤纤维(NDF)

酸性洗涤纤维(ADF)

对照组

62.25a

74.78b

81.57a

42.07

15.07

20.66

13.23

L-DNJ组

61.35ab

75.17ab

79.84ab

43.44

13.54

21.02

12.34

H-DNJ组

60.79b

76.25a

78.35b

42.23

14.56

20.68

14.88

标准误

1.237

1.568

2.469

0.550

0.351

0.653

0.394

P值

0.037

0.034

0.020

0.357

0.153

0.228

0.180

表3 桑叶DNJ对新西兰白兔养分表观消化率的影响（%）

2.3 桑叶DNJ对兔肉品质的影响

由表 4 可知，与对照组相比，L-DNJ 组和 H-DNJ

组兔肉红度(a*

）显著提高（P<0.05），兔肉中粗脂肪

含量显著降低（P<0.05）；H-DNJ 组兔肉亮度(L*

）显

著降低（P<0.05）；L-DNJ 组和 H-DNJ 组兔肉 pH45 min、

pH24 h下降、滴水损失、剪切力、水分和粗蛋白含量无显

著变化（P>0.05）。

2.4 桑叶DNJ对兔肉脂肪酸组成的影响

项目

pH

pH45 min

pH24 h

pH24 h下降

肉品质

L*

a

*

b

*

滴水损失(%)

剪切力(N)

肌肉营养成分(%)

水分

粗蛋白

粗脂肪

对照组

6.61

5.82

0.80

58.42a

1.19b

8.32

3.63

32.62

75.29

21.86

3.10a

L-DNJ组

6.62

5.87

0.76

55.82ab

1.56a

8.32

3.56

32.86

75.93

22.09

2.50b

H-DNJ组

6.77

5.89

0.87

55.34b

1.71a

8.35

3.17

33.51

75.20

22.18

0.60c

标准误

0.031

0.089

0.035

0.162

0.016

0.047

0.044

0.530

0.634

0.353

0.034

P值

0.172

0.329

0.435

0.036

0.035

0.239

0.368

0.241

0.453

0.076

0.014

表4 桑叶DNJ对兔肉品质的影响

由表5可知，用GC/MS检测兔肉脂肪酸组成和含

量，共检测出26种脂肪酸，其中饱和脂肪酸（saturated

fatty acid，SFA）13种，单不饱和脂肪酸（monounsaturat⁃

ed fatty acid，MUFA）6种，多不饱和脂肪酸（polyunsat⁃

urated fatty acid，PUFA）7 种。26 种脂肪酸中，C14 ：

0、C16 ：0、C18 ：0、C16 ：1n7c、C18 ：1n9c、C18 ：

89

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

1n9t、C18 ：2n6c、C20 ：4n6c 含量均高于 1%，其中

C16 ：0 和 C18 ：2n6c 含量最高，含量在 30% 左右，

C18 ：1n9c次之，含量在22%左右。SFA中，L-DNJ组

C12 ：0和12Methyl C13：0含量显著高于对照组和HDNJ组（P<0.05），H-DNJ组C16 ：0和C18 ：0含量显著

低于对照组和L-DNJ组（P<0.05），C17 ：0含量显著高

于对照组和 L-DNJ 组（P<0.05），L-DNJ 和 H-DNJ 组

13Methyl C14 ：0含量显著高于对照组（P<0.05）；MUFA

中，L-DNJ组C18：1n9c含量显著低于对照组和H-DNJ

组（P<0.05），H-DNJ 组 C18 ：1n9t 和 C20 ：1n9t 含 量

显 著 高 于 对 照 组 和 L-DNJ 组（P<0.05）；PUFA 中，

H-DNJ 组 C16 ：3n4c、C18 ：2n6c 和 C20：4n6c 含量显

著高于对照组和 L-DNJ 组（P<0.05），L-DNJ 组 C20 ：

2n6c含量显著低于对照组（P<0.05），H-DNJ组检测到

C22 ：5n6c 含量为 0.13%，而对照组和 L-DNJ 组未检

测到。根据统计分析，与对照组相比，H-DNJ 组兔肉

中 SFA 含量显著降低（P<0.05），PUFA（P<0.05）和总

不饱和脂肪酸（UFA，P<0.05）含量显著提高。

2.5 桑叶DNJ对兔肉抗氧化性能的影响

由表6可知，与对照组相比，其余两组兔肉GSH-Px

活性显著提高（P<0.05），H-DNJ 组兔肉 T-AOC 显著

提高（P<0.05），L-DNJ 组和 H-DNJ 组兔肉 SOD 活性

和MDA含量无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 桑叶 DNJ对新西兰白兔生长性能和养分表观消

化率的影响

由于桑叶DNJ具有降低血糖、调节脂质代谢的作

用，大量采食可能不利于动物育肥，影响生长性能。

Hou 等[7]

在皖西白鹅饲粮中添加桑叶 DNJ，发现其通

过降低鹅肠道淀粉酶和脂肪酸活性，改变肠道菌群结

构，进而影响动物对饲粮营养物质的消化吸收，降低

生长性能。钟经波等[9]

和谢辉等[12]

发现高浓度桑叶

DNJ（0.4 g/kg和2.0 g/kg）能够降低新西兰白兔十二指

肠淀粉酶活性和对饲粮干物质和粗脂肪的消化率，造

成动物体重增长缓慢。本试验根据兔饲粮中桑叶的

适宜饲喂量添加DNJ，发现H-DNJ组新西兰白兔对干

物质和粗脂肪的表观消化率降低，动物体重增长减

缓，与钟经波等[9]

和谢辉等[12]

的研究结果一致，说明正

常桑叶饲喂量下 DNJ 仍然具有改变动物对饲粮养分

利用的作用，进而影响动物生长性能。饲粮干物质为

可被动物利用的有机物，干物质消化率越高则动物获

得的总养分越多，反之则越少；脂肪是饲粮中能量含

量最高的物质，粗脂肪表观消化率降低预示动物获得

的能量减少，机体会通过消耗体内贮存的能量物质

（如糖原、脂肪）满足生命活动需要，长期能量供应不

足会造成机体瘦削，体重下降[13]

。研究显示，动物还

可以通过提高机体蛋白质周转速率，加快蛋白质代谢

为机体提供能量[14]

，这可能是DNJ处理组粗蛋白表观

消化率提高的内在原因。

表5 桑叶DNJ对兔肉脂肪酸组成的影响（%）

项目

SFA

C10 ：0

C12 ：0

12Methyl C13 ：0

C14 ：0

9Methyl C14 ：0

13Methyl C14 ：0

C15 ：0

14Methyl C15 ：0

C16 ：0

14methyl C16 ：0

C17 ：0

C18 ：0

C20 ：0

MUFA

C16 ：1n9c

C16 ：1n7c

C17 ：1n7c

C18 ：1n9c

C18 ：1n9t

C20 ：1n9t

PUFA

C16 ：3n4c

C18 ：2n6c

C20 ：4n6c

C20 ：3n6c

C20 ：2n6c

C22 ：4n6c

C22 ：5n6c

?SFA

?MUFA

?PUFA

?UFA

对照组

0.31

0.98b

0.20b

2.11

0.07

0.10b

0.51

0.27

29.50a

0.10

0.47b

7.41a

0.13

0.46

2.53

0.25

22.43a

1.13b

0.14b

0.11b

29.99b

1.52b

0.16

0.71a

0.38

ND

42.11a

26.24

32.52b

58.76b

L-DNJ组

0.20

1.71a

0.30a

2.16

0.06

0.12a

0.52

0.27

30.16a

0.11

0.46b

8.22a

0.11

0.51

1.89

0.22

20.60b

1.08b

0.16b

0.13b

28.40b

1.61b

0.15

0.44b

0.39

ND

44.48a

24.45

31.12b

55.57b

H-DNJ组

0.25

0.92b

0.14b

2.14

0.07

0.13a

0.53

0.26

26.52b

0.10

0.52a

5.11b

0.11

0.42

2.06

0.21

23.01a

2.86a

0.24a

0.19a

31.77a

2.67a

0.43

0.57ab

0.31

0.13

36.75b

27.13

36.07a

63.20a

标准误

0.029

0.106

0.019

0.147

0.002

0.004

0.022

0.012

0.438

0.004

0.007

0.399

0.007

0.021

0.181

0.010

0.405

0.144

0.011

0.008

0.564

0.147

0.060

0.036

0.017

0.871

0.551

0.696

0.880

P值

0.318

0.001

0.001

0.784

0.652

0.008

0.956

0.958

<0.001

0.591

<0.001

0.001

0.515

0.249

0.341

0.218

0.031

0.049

<0.001

<0.001

0.005

0.016

0.077

0.005

0.065

<0.001

0.080

0.001

<0.001

注：“ND”表示未检测到。

同时，本研究还发现，正常桑叶饲喂量下 DNJ 不

会引起动物采食量下降，与钟经波等[9]

的结果不同，说

明正常桑叶饲喂量下 DNJ 不是桑叶中影响动物采食

90

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

项目

T-AOC(U/mg prot.)

SOD(U/mg prot.)

GSH-Px(U/mg prot.)

MDA (nmol/mg prot.)

对照组

0.68b

24.66

5.75c

0.43

L-DNJ组

0.78ab

25.01

6.36b

0.41

H-DNJ组

0.82a

25.91

7.88a

0.45

标准误

0.016

0.303

0.642

0.068

P值

0.026

0.213

0.007

0.131

表6 桑叶DNJ对兔肉抗氧化指标的影响

量的成分。然而，桑叶DNJ确实可以帮助人类减少食

物摄入以预防和治疗肥胖。一项针对高脂饮食诱导

的肥胖小鼠的研究发现，DNJ能够通过提高下丘脑脂

联素水平抑制小鼠采食量，进而调节小鼠体重[15]

。

3.2 桑叶DNJ对新西兰白兔肉品质的影响

家兔宰杀放血后，机体内环境的pH平衡被打破，

肌肉组织的 pH 由生活状态下的 7.1~7.2 下降到 6.2~

6.4，24 h左右 pH降为 5.6~5.8，然后这种 pH水平会一

直维持到细菌分解初期[16]

。本研究所测兔肉的pH与

文献报道的相近，与钟经波等[9]

研究结果一致，与

Khan 等[17]

用桑叶饲喂家兔的效果相似。然而，Fan

等[18]

用桑叶喂猪，发现桑叶可以延缓猪肉 24 h 内 pH

下降速度，并推测是桑叶中多酚类物质抗氧化的结

果。本研究中，DNJ 虽然也具有抗氧化活性，但并没

有减缓 24 h 兔肉的 pH 下降速度，可能是由于其抗氧

化活性不如多酚类强。

本研究一个有趣的发现是，随着饲粮中DNJ浓度

的增加，兔肉的亮度（L*

）减弱，红度（a*

）增强，即兔肉

的颜色偏深红色，这非常符合消费者对肉类的感官偏

好。然而钟经波等[9]

的研究结果显示桑叶DNJ能够提

升兔肉亮度（L*

），对兔肉红度（a*

）无影响。肉色是感

官指标，主要由肌肉中肌红蛋白和血红蛋白的含量和

化学状态，以及肌肉中脂肪和水分含量等因素决定。

紫红色的脱氧肌红蛋白与氧结合生成鲜红色的氧合

肌红蛋白，脱氧肌红蛋白和氧合肌红蛋白均可以被氧

化生成褐色的高铁肌红蛋白，使肉色变暗[19]

。可能本

研究中桑叶 DNJ 的添加量较钟经波等[9]

低，抗氧化活

性较弱，未能阻止肌红蛋白氧化变暗。肌肉脂肪和水

分含量越高，肉质颜色越浅[19]

。本研究DNJ处理组兔

肉水分含量没变，但脂肪含量显著低于对照组，对肉色

变暗也有一定的作用。另外，肌肉游离葡萄糖含量与肉

色变深也有关联[19]

。研究显示，DNJ可下调钠/葡萄糖协

同转运蛋白 1（SGLT1）、葡萄糖转运蛋白 2（GLUT2）和

Na/K-ATP 酶的 mRNA 表达量，减少葡萄糖在肠道的

吸收，降低糖异生关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶

（PEPCK）和葡糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的表达量[20]

，

从而降低肌肉游离葡萄糖水平。

DNJ 具有调节脂质代谢的作用。Wang 等[21]

研究

表明，DNJ 通过 ERK/PPARy 信号通路抑制猪肉脂肪

细胞的生成。DNJ 还能增加 PPARa 和 AMPK 基因的

mRNA 表达量，提升肝脏脂肪酸 β 氧化酶的活性与

mRNA 表达量，激活 β氧化系统，从而促进脂肪分解，

防止脂肪积累[22]

。本研究桑叶 DNJ 处理组兔肉脂肪

含量显著低于对照组，且与剂量呈负相关，这与 DNJ

减少脂肪生成、促进脂肪分解的作用一致。

3.3 桑叶DNJ对兔肉脂肪酸组成的影响

兔肉除了其“四高”（高赖氨酸、高蛋白质、高磷

脂、高消化率）和“三低”（低胆固醇、低脂肪、低热量）

的特点以外，兔肉中脂肪酸组成作为其营养价值的重

要方面被广泛研究。本试验结果显示，兔肉中UFA含

量在 55% 以上，略高于 SFA 含量；SFA 主要由棕榈酸

（16 ：0）和硬脂酸（18 ：0）组成，占SFA含量的90%左

右；MUFA 中油酸（18 ：1n9）含量最高，占 MUFA 含量

的 85% 以上；PUFA 主要由亚油酸（C18 ：2n6c）和花

生四烯酸（C20 ：4n6c）组成，占 PUFA 含量的 95% 以

上。这 5 种脂肪酸的总含量占总脂肪酸含量的 90%

左右，检测结果与Lullere等[23]

相近。

本研究发现，桑叶DNJ处理组兔肉中SFA含量显

著降低，PUFA 含量显著提高。目前关于桑叶 DNJ 影

响动物肉产品脂肪酸组成的研究较少。Martínez等[24]

用桑叶替代苜蓿饲喂肉兔，发现兔肉总 SFA和 MUFA

含量显著降低，PUFA 含量显著提高。李飞鸣等[25]

在

宁乡土杂猪饲粮中添加13%和16%发酵桑叶，发现发

酵桑叶能降低猪肉总 SFA 含量，提高 PUFA 含量。这

些研究与本文的结果相近，说明DNJ可能是桑叶中提

高动物肉产品 PUFA 含量的重要成分。研究显示，亚

油酸（C18 ：2n6c）具有降低血脂、软化血管、降低血

压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发

病率；花生四烯酸（C20 ：4n6c）是人的大脑和视神经

发育的重要物质，对人的智力和视神经的敏感性具有

91

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

重要作用；二十二碳五烯酸（DPA，C22 ：5n6c）在抗

炎、抑制细胞因子合成、减少血栓形成、降低血脂、抑

制动脉粥样硬化等许多方面对人体健康有益[26-27]

。

本研究饲粮添加 0.28 g/kg 桑叶 DNJ 可显著提高兔肉

中亚油酸（C18 ：2n6c）、花生四烯酸（C20 ：4n6c）和

DPA（C22 ：5n6c）含量，预示桑叶 DNJ 具有作为饲料

添加剂生产更有利于人类健康的肉产品的潜力。

3.4 桑叶DNJ对兔肉抗氧化性能的影响

已有大量文献揭示 DNJ 具有抗氧化活性。Tang

等[28]

发现给罗非鱼饲喂 DNJ 可提升鱼脾细胞 SOD 和

CAT活性，降低脂质氧化终产物MDA水平。Piao等[29]

给胃溃疡小鼠口服 DNJ，也发现小鼠胃中 SOD、CAT

活性上升而MDA水平下降。前人研究大多检测的是

动物血浆的抗氧化参数，而本研究检测了兔肉的抗氧

化指标，更能直接反映桑叶 DNJ 对动物肉产品的影

响。本研究发现桑叶 DNJ 处理组兔肌肉组织的抗氧

化能力有一定程度的提升，有利于延长动物肉产品的

货架期。

4 结论

H-DNJ 组新西兰白兔对饲粮干物质和粗脂肪的

表观消化率显著降低，平均日增重和兔肉脂肪含量降

低，兔肉红度（a*

）提高，改善感官效果吸引消费者。

桑叶DNJ处理组兔肉中SFA含量降低，PUFA含量

提高，其中亚油酸（C18 ：2n6c）、花生四烯酸（C20 ：

4n6c）和DPA（C22 ：5n6c）含量的提高对人类健康有益。

饲粮补充桑叶 DNJ 能够一定程度上提高动物肉

产品的抗氧化能力，延长货架期。

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92

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

摘 要：随着人民生活水平的提高，伴侣动物如犬、猫等受到越来越多家庭的喜爱，对于宠物粮

食的需求也由传统粮食逐渐向能够改善其健康的功能粮方面转变。益生菌是一类能够在动物体内

定植的活性微生物，具有调控肠道菌群平衡、维持动物机体健康、促进营养吸收等作用。文章对益生

菌的定义、菌株选择标准及其在宠物粮食中的应用进行了综述，分析了不同加工方式可能对益生菌

的影响，旨在科学合理地加工含益生菌的功能粮食，保证其生物活性，为改善宠物健康提供思路。

关键词：益生菌；伴侣动物；菌株；加工方式；宠物食品

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.014

中图分类号：S816.3 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0093-06

Research Advances of Probiotics and Its Application Status in Pet Food Processing

ZHANG Saisai

(Shanghai Chongji Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 200082, China)

Abstract：With the improvement of people's living standards, companion animals such as dogs and cats

are loved by more and more families, and the demand for pet food has gradually changed from traditional

food to functional food that can improve their health. Probiotics are a type of active microorganisms that

can colonize animals. They can regulate the balance of intestinal flora, improve the health of animals,

and promote nutrient absorption. This article re⁃

views the definition of probiotics, strain selection

criteria and their application in pet food, and ana⁃

lyzes the possible impact of different processing

methods on probiotics, aiming to scientifically and

作者简介：张赛赛，硕士，研究方向为动物营养与饲料

科学。

收稿日期：2023-05-18

益生菌研究进展及其在宠物食品加工中的应用现状

■ 张赛赛

（上海宠济生物科技有限公司，上海 200082）

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（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

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93

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

伴侣动物已成为社会中非常重要的成员，如犬在

过去两个世纪里的社会角色已经从主要劳力（即监

护、运输、放牧和狩猎）演变为能够胜任包括特殊行动

（如救援、军事）、治疗护理（如疾病检测、帮助感官受

损者）和陪伴等工作的一系列角色[1]

。考虑到它们在

人类生活中的地位越来越重要，对于伴侣动物粮食的

关注点也从能否提高其生产力转变为能否改善其健

康、寿命和生活质量。这种转变直接体现在功能粮的

出现，功能粮作为一种新兴产品，除提供必需的营养

素外，更重要的是能够促进机体健康[2]

。功能粮的有

效成分包括植物提取物、纤维、关节补充剂、非必需营

养素或微生物和酵母衍生产品，可通过发挥预防或治

疗作用来提高宠物食品的价值[3]

。益生菌几个世纪以

来一直用于人类食品发酵生产，如酸奶、奶酪、葡萄酒

和面包等，近些年被视为健康食品的促进补充剂[4]

。

但益生菌对宠物的功效是一个相对较新的研究领域，

文章对益生菌在宠物食品中的应用进行了综述并展

望了潜在发展方向。

1 益生菌

益生菌是指对人类或动物有益的一类活性微生

物[5]

，主要包括细菌和酵母等。对于动物而言，益生菌

通常具有提高其生产性能[6-7]

以及抗病力[8]

的作用，同

时也具有一定的替代抗生素的潜力。益生菌是活的微

生物，当给予足够的量时，会给宿主健康带来益处[9]

，据

估测，2020—2027年间益生菌强化食品市场预计将从

480亿美元增长到940亿美元，复合年增长率为7.9%。

然而相对于人类和畜禽，益生菌在猫和犬上的应用研

究仍较为缺乏。PubMed数据库中1990—2021年间以

“人类”和“益生菌”为关键词搜索中相关出版物超过

20 000篇，而以“犬”和“益生菌”为关键词仅搜索到相

关出版物仅有约 250篇。尽管研究较少，但益生菌在

宠物补充剂、食品和零食中得到快速的推广应用，并

且已经通过了部分临床实践[10-13]

。美国食品和药物

管理局兽医中心与美国饲料控制官员协会（AAFCO）

于 1989年首次发布了可用于猪和家禽等动物饲料的

细菌和酵母生物清单，经过多年的修订，目前有 41种

非产毒细菌被认为可安全应用于伴侣动物食品中[14]

。

我国农业农村部允许使用的饲料微生物添加剂的菌

种有 34 种，分为乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母菌类和

光合细菌类等[15]

。这些微生物可以根据生理特征如

细胞壁结构、耐氧性以及是否形成孢子来进行分类。

2 益生菌菌株选择标准

一般来说，作为候选益生菌不但要满足安全和监

管指南要求，还应对胃肠道中两种主要化学应激源

（酸、胆汁盐）具有一定程度的抵抗力[16-18]

。此外，任

何用于商业加工宠物食品的菌株都应该在温度等外

部条件发生变化或和食品本身化学成分（即基质酸

度、氧气存在、水活性或存在微生物抑制剂[19]

）发生变

化时表现出较高的耐受性。宠物食品中添加益生菌

与传统宠物食物相比可以提高产品的感知价值[20]

，但

如果在选择益生菌时没有考虑上述特征，实际应用效

果难以保证。研究人员通过对市面上的宠物食品调

查研究发现，53%的抽样商业产品标签上的菌株分类

和菌落形成单位保证值方面存在严重不足[21]

，这表明

需要对益生菌菌株活性进行验证，以确保动物食用时

菌株的活性。

益生菌的代谢活动具有菌株特异性，同一细菌的

不同菌种或菌株并非都具有相同的代谢途径[22]

。肠

球菌、乳杆菌和双歧杆菌是动物最常用的益生菌，它

们的主要终产物为乳酸。传统意义上产乳酸菌株是

革兰氏阳性厌氧菌或兼性厌氧菌且不形成孢子[23]

，但

这些菌株会产生其他物质，例如过氧化氢和细菌素，

这些物质会影响宿主微生物群[24]

。近期报道中系统

评价了上述益生菌对犬的健康益处，包括改善粪便质

量和对表观全消化道消化率、微生物发酵终产物以及

免疫系统反应的综合影响[25-27]

。然而，可应用于食品

中的营养细胞（正常生活的细菌细胞）较易因烹饪和

在胃肠道环境等压力而受损和死亡，因此需要使用

例如微囊化等细胞保护技术等来增强这些微生物的

存活率[28]

。这是一个不断发展的研究领域，对于含有

非孢子形成益生菌的功能性食品的未来至关重要。

3 宠物食品加工工艺对益生菌的影响

绝大多数宠物食品都需经过一定程度的烹饪或

灭菌，以达到延长保质期并降低病原微生物等在成品

rationally process functional food containing probiotics to ensure its biological activity provides ideas for

improving pet health.

Key words：probiotics; companion animals; strains; processing methods; pet food

94

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

中持久存在的风险的目的。热处理可减少或破坏有

害微生物活性，但如果处理不当，加热过程也可能对

益生菌造成破坏，导致其细胞外膜和肽聚糖壁、细胞

质膜完整性的丧失以及细胞器、RNA、DNA 和酶的变

性[29]

，选用适当的加工方法尤为重要。

3.1 挤压

挤压是当今宠物食品商业生产中使用最广泛的

技术，研究表明在挤压过程中施加到食物的热能与

机械能的比率会影响宠物食品颗粒的结构特征[30-31]

。

嗜热微生物如芽孢杆菌菌种由于具有较高的耐热性，

可根据其数量变化来判断加工工艺能否实现灭菌作

用，因此该菌种被普遍应用于工艺验证研究[32]

。Oke⁃

lo等[32]

研究中将挤压机机筒出口温度、糖浆进料水分

含量和机筒停留时间等因素组合在一起形成了 15种

工艺组合，结果表明当饲料在 24.5% 水分含量、3 s停

留时间和82 ℃或更高模具温度挤压时沙门氏菌无存

活，嗜热芽孢杆菌仍有存活，证明了形成孢子的微生

物在挤压过程中具有存活下来的潜力。

3.2 蒸煮烹饪

大多数宠物食品的蒸煮烹饪过程需要在低酸高

水分条件下注入蒸汽，使产品加热至 121 ℃以上，目

的是消除营养性病原体和腐败微生物以及肉毒杆菌

孢子，最终使产品实现无菌。根据食品成分和包装类

型，在 3~10 min 的升温期间将杀菌锅升温，并于

121 ℃下保持至少2 min，如果这种病原体恰好存在于

原材料基质中，则保持时间必须足够长以实现孢子数

量的减少。烹饪过程的严苛条件使得最顽强的微生

物也难以存活，但包括益生元和后生元等在内的功能

性成分可能会被保留。

3.3 冷冻干燥

冷冻干燥被认为是一种相对温和的脱水过程，冷

冻干燥过程没有外部热量并且使用冷冻干燥法去除

水的速度很慢。随着市场对具有高生物利用度和较

少热处理的产品的需求不断增加，冷冻干燥的宠物食

品和零食在过去十年中受到市场欢迎。由于产品在

没有外部热量的情况下脱水，因此冷冻干燥不被视为

烹饪过程，但根据产品的设计，冻干宠物食品配方中

使用的成分可以是预煮的或生的。宠物食品中使用

的许多益生菌制剂最初都是借助保护性介质通过冷

冻干燥来保存的，这种保护性介质有助于防止细胞膜

和蛋白质因细胞核中流失水分而受损，从而延长了益

生菌培养物的货架期。益生菌脱水后由于其细胞含

水量已经很低，冻干过程中除去的水分主要来自细胞

外周而非细胞内，因此比未脱水的益生菌更适合与粮

食混合后进行冷冻干燥。对于未脱水的营养细胞，冻

干过程会使细胞内形成冰晶，造成细胞膜结构的破

坏，从而损伤细胞[33]

。革兰氏阴性菌的细胞壁内存在

较薄的肽聚糖层和脂多糖，因此革兰氏阴性菌相对于

革兰氏阳性菌株的存活率较低[34]

。然而，冷冻干燥对

活细胞的破坏作用不足以减轻食源性病原体的风险，

因此许多冻干宠物食品和零食可能会经过独立于冻

干循环的辐照或高压处理等对其进行额外加工。

3.4 烘焙

烘焙在面包、零食、蛋糕、玉米饼、糕点、馅饼、宠物

零食、宠物食品等产品加工过程中应用广泛。传统的

烘焙产品主要由谷物粉组成，但基于肉类配方的烘焙

产品在宠物食品行业也较为常见。烘焙过程中活微生

物遇到的主要压力源是热量，烘焙持续的时间和温度

足以灭活大肠杆菌或沙门氏菌病原体，但目前尚未有

针对不同烘焙过程中病原菌或直接可饲喂微生物灭活

效果的科学验证。有试验表明，在190.6 ℃条件下经过

17 min的烘焙，肠道沙门氏菌亚种由8 log CFU/g减少至

3 log CFU/g，而烘焙21 min才能减少至1.9 log CFU/g[35]

；

在 传 统 烤 箱 中 烘 焙 13 min 的 汉堡面包需要高达

218.3 ℃才能达到减少至 2 log CFU/g[36]

。这表明微生

物存活率的可变性可能取决于烘焙温度和时间以及

微生物固有的耐热特性。为了规避热应激，将益生菌

细胞包裹在烘焙产品表面的可食用薄膜或涂层中是

一种具有发展前景的方法，在以海藻酸钠为底物的成

膜溶液中，浓缩乳清蛋白可将益生菌悬浮在上述凝胶

中，用作烘焙食品的局部涂层。由94%的水、5%的淀

粉和1%的微胶囊化益生菌组成的功能性淀粉基涂层

应用于面包并于180 ℃下烘焙16 min后，微胶囊化嗜

酸乳杆菌的存活率达到63%[37]

。研究表明，植物乳杆

菌（CIDCA83114菌株）在30 ℃烘焙40 min后，使用玉

米淀粉基薄膜（活细胞计数减少 4 个对数）比海藻酸

钠薄膜（活细胞计数减少 6个对数）提高了存活率[38]

，

这表明基于淀粉的悬浮液可能比其他薄膜更有效地

保护烘焙条件下的益生菌活性。考虑到微生物制备、

宠物食品和治疗配方中使用的原材料、应用方式和加

工条件等各个环节涉及的范围较广，有必要将益生菌

活性验证作为商业化标准流程的一部分。

4 益生菌在伴侣动物中的功效研究现状

猫和犬的消化系统相对简单，适合消化高蛋白质

95

特 种 养 殖 2023年第44卷第18期 总第687期

的食物。相对于犬，猫是相对严格的食肉动物，对葡

萄糖等碳水化合物利用率低，对高蛋白质食物的要求

更高[39]

；虽然犬与猫有许多相同的解剖学和代谢特

征，但犬更偏向于杂食，可消化、吸收和代谢大量碳水

化合物[40]

。由于猫和犬具有不同的饮食需求和消化

系统，它们对益生菌的需求以及益生菌产生的效果也

不同。

4.1 犬用益生菌

胃肠道疾病是犬类最常见的健康问题之一[41]

，大

多数表现为急性或慢性腹泻，在某些情况下表现为呕

吐或厌食[42]

。已有研究表明不同类型的益生菌对于

治疗犬的肠道疾病具有积极结果[43]

。目前在犬上研

究应用较多的益生菌包括乳杆菌属（Lactobacillus）和

肠球菌属（Enterococcus）。例如，饲喂犬源约氏乳杆菌

（L. johnsonii CPN23）能够降低雌犬血浆葡萄糖和胆固

醇水平，并增加高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比率[44]

，

同时增加提高其纤维消化率，增加粪便短链脂肪酸浓

度、降低氨浓度[45]

；饲喂犬源发酵乳杆菌（L. fermen⁃

tum CCM 7421）能够提高犬只粪便乳酸菌数量、降低

梭菌数量，改善血液中的总蛋白质、胆固醇和丙氨酸转

氨酶水平[46]

；此外，饲喂鼠乳杆菌（L. murinus LbP2）[47]

或嗜酸乳杆菌（L. acidophilus D2/CSL）[48]

能够改善犬

只体况评分、粪便稠度、精神状态及食欲。肠球菌研

究方面，饲喂屎肠球菌（E. faecium DSM 32820）犬只

在整个试验过程中具有最佳的粪便稠度，刺激了血液

吞噬细菌活性和白细胞代谢活性[49]

；饲喂屎肠球菌

（E. faecium SF68）能够改善犬只腹泻症状并消除贾第

鞭毛虫包囊[50]

，同时提高三酰甘油浓度并降低胆固醇

浓度[51]

。除上述两类益生菌之外，也有研究发现饲喂

双歧杆菌（Bifidobacterium animalis Bb12）的犬只粪便

中三酰甘油和白蛋白浓度显著降低，乙酸、乙酰乙酸

和戊酸浓度增加[52]

。益生菌之间也可能存在协同作

用，例如，同时饲喂犬只乳杆菌（L. casei Zhang 和 L.

plantarum P-8）和双歧杆菌（B. animalis subsp. lactis

V9）能够显著提高其平均日采食量和平均日增重，增

加粪便中的有益细菌并减少潜在有害细菌数量[53]

。

4.2 猫用益生菌

与犬相比，益生菌在猫中使用的研究较少，而且

由于生理特征和日粮组成的差异，益生菌对猫生长和

健康的作用功效无法完全从犬的研究结果中推断[54]

。

与犬相似的是，在猫上研究应用的益生菌主要也是乳

杆菌属和肠球菌属，其中屎肠球菌 SF68 对猫的益生

作用研究较多：幼猫阶段，屎肠球菌SF68能够通过提

高 CD4+淋巴细胞比例改善其免疫力[55]

；在成年猫阶

段，屎肠球菌 SF68 能够缓解其腹泻发生率[56-57]

，同时

使粪便微生物多样性，这表明微生物群更稳定；此外，

屎肠球菌 SF68 对改善感染慢性猫科动物疱疹病毒 1

的猫肠道微生物群落稳定性，并降低了与该病毒感染

相关的发病率[58]

。除屎肠球菌外，添加另一种肠球菌

属的益生菌——多毛肠球菌（E. hirae）能够提高该菌

在幼猫肠道中的定植水平[59]

。乳杆菌属方面，嗜酸乳

杆菌 DSM13241 可增加成年猫粪便中有益的嗜酸乳

杆菌和嗜酸乳杆菌群的数量，并减少梭菌属的数量，

降低粪便pH和血浆内毒素浓度[54]

；另一方面，嗜酸乳

杆菌D2/CSL能够改善健康成年猫的粪便形态并增加

粪便中的乳杆菌数量[60]

。

5 结论

益生菌有助于促进伴侣动物的健康和保健，在实

际生产中，益生菌产品主要以饲料添加剂、膳食补充

剂和含益生菌食品的形式出现，但在宠物食品加工过

程中如何保证益生菌活性、保证产品的功效仍存在许

多挑战，因此，选择合适的菌株至关重要。在选择宠

物食品生产应用中挑选益生菌菌株要考虑生理特性

（尤其是耐热性、耐氧性、耐酸和胆汁性）、稳定方法

（如孢子形成、冷冻干燥或封装）、加工条件（包括时

间、温度、压力、水分、水分活度、pH）、使用方法、包装

和储存条件等，且未来在开发应用新型益生菌菌株或

在对加工条件、产品配方或包装设计进行任何调整时

均应验证益生菌的活性。

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（编辑：王博瑶，wangboyaowby@qq.com）

98

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响

■ 张 伟1 段佳燚2 马铭环3 郭振环4* 马 霞4

（1.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061；

3.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；4.河南牧业经济学院动物医药学院，河南郑州 450046）

摘 要：为了研究茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响，筛选出二者最佳配伍比

例，为开发含有“茵陈-大黄”的新药提供有效的参考依据。试验选用茵陈和大黄 1∶1、1∶2和 2∶1

三个不同配伍比例，再按照大黄同时下、后下进行煎煮；选取部分水煎液分别按照醇沉浓度为70%和

80%水煎醇沉方法制备绿原酸和蒽醌类成分，采用HPLC法测定水煎液、醇沉浓度分别为70%与80%

的上清液、沉淀中绿原酸及蒽醌类成分的含量。结果显示：茵陈、大黄配伍后绿原酸的含量均有所提

高，且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为 1∶1，提取出绿原酸含量为 55.96 mg/mL；茵陈、大

黄配伍后蒽醌类成分含量也有所提高，其中大黄酸含量提高最为显著，提取出大黄酸含量为

20.83 mg/mL，且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶2。茵陈、大黄配伍后绿原酸含量在配

伍比例1∶1、蒽醌类成分在配伍比例1∶2时含量有所提高。

关键词：茵陈；大黄；绿原酸；蒽醌；水煎醇沉

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.015

中图分类号：S816.2 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0099-08

Effects of Different Ratios of Herba Artemisias Capillaris and Rhubarb on Chlorogenic Acid

and Anthraquinones

ZHANG Wei1

DUAN Jiayi2

MA Minghuan3

GUO Zhenhuan4*

MA Xia4

(1. Haidu College Qingdao Agricultural University, Shandong Laiyang 265200, China; 2. Shandong

Vocational Animal Science and Veterinary College, Shandong Weifang 261061, China; 3. School of Animal

Medicine, Qingdao Agricultural University, Shandong Qingdao 266109, China; 4. College of Veterinary

Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Henan Zhengzhou 450046, China)

Abstract：To studied the effect of different ratio of Herba Artemisias Capillaris and Rhubarb on chloro⁃

genic acid and anthraquinones, and to selected the best compatibility ratio, so as to provided effective ref⁃

erence for the development of new drugs containing \"Yinchen-Rhubarb\". Three different compatibility ra⁃

tios of Herba Artemisias Capillaris and Rhubarb at 1∶1, 1∶2 and 2∶1 were selected, and then Rhu⁃

barb was decocted according to Rhubarb at the same time. Part of the water decoction was selected to

prepare Chlorogenic acid and anthraquinones according to the alcohol precipitation method with 70%

and 80% alcohol precipitation concentration, respectively. The contents of Chlorogenic acid and anthra⁃

quinones in the supernatant and precipitation were determined by HPLC. The results showed that the con⁃

tent of chlorogenic acid increased after the compatibility of Artemisia Chinensis and Rhubarb, and the

best compatibility ratio of water decoction and alcohol precipitation was 1∶1, and the content of chloro⁃

genic acid extracted was 55.96 mg/mL. The content of anthraquinones also increased after the compatibil⁃

ity of Artemisia Chinensis and Rhubarb, in which the content of Rhein increased most significantly, and

the content of Rhein extracted was 20.83 mg/mL,

and the best compatibility ratio of water decoction

method and water decoction and alcohol precipita⁃

tion method was 1∶2. The content of Chlorogenic

acid and anthraquinones increased when the com⁃

patibility ratio was 1∶1 and the ratio of anthra⁃

作者简介：张伟，硕士，副教授，研究方向为中兽药新制剂。

*通讯作者：郭振环，博士，教授。

收稿日期：2023-08-15

基金项目：河南牧业经济学院兽医学重点学科[XJXK202202]

99

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

quinones was 1∶2 after compatibility of Herba Artemisia and Rhubarb.

Key words：herba artemisias capillaris; rhubarb; chlorogenic acid; anthraquinone;water frying and alco⁃

hol sinking

茵陈为菊科植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部

分[1]

，性味苦、辛，微寒；归脾、胃、肝、胆经；主治清湿

热，利胆退黄。大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大

黄或药用大黄的干燥根及根茎[1]

，性味苦，寒；归胃、大

肠、肝、脾经；主治清热泻下，利肠通便，凉血止血，解

毒活血，逐瘀通经。“茵陈-大黄”作为利湿退黄的经典

药对，最早出自茵陈蒿汤，两药合用，利湿与泄热同

行，二便通利，湿热得行，瘀热得下，黄疸自退[2-3]

。茵

陈和大黄作为药对，在许多古方和中成药制剂中被使

用，例如茵陈蒿汤、茵陈胆道汤、黄疸茵陈颗粒、柴胡

茵陈汤、茵陈四苓颗粒等，且其不同的配伍规律展现

出不同的药效[4-5]

。

绿原酸类物质分子结构复杂，合成成本高昂。在

自然界中绿原酸却来源广泛，主要被发现存在于高等

双子叶植物和蕨类植物中，例如菊科蒿属植物（如向

日葵）、忍冬科忍冬属（如金银花）、杜仲科杜仲属（如

杜仲）。研究发现，不同植物所含绿原酸种类不同，而

在茵陈中含量较高的则为1,5-二咖啡酰奎宁酸，随后

才是绿原酸和异绿原酸A。其具有抗氧化活性、抗菌

抗病、进行免疫调节以及调节糖脂代谢的功能[6]

。

茵陈含有多种化学成分，主要类型为黄酮、香豆素、

有机酸、稀炔、色原酸、醛酮、胆碱等[7]

。研究发现，茵陈

具有显著的保肝利胆作用、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑菌

和抗病毒等作用。相关药理机制为茵陈及其单体化合

物可调控PI3KIAktNF-κB等信号通路，影响caspase-1、

Smad3等蛋白和iNOS、COX-2、TNF-α等细胞因子的表

达，发挥其保肝利胆、退黄利湿、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和

神经系统等药理活性[8]

。大黄含有蒽醌、鞣质类、有机

酸、苷类化合物和挥发油等化学物质。在临床用药过程

中，大黄发挥主要药理作用的活性成分为蒽醌，包括游

离及结合型大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等[9-10]

。大黄酸

可通过调节肠道菌群，间接改变肠道嘌呤代谢，从而减

轻结肠炎。大黄提取液干预脑出血模型大鼠后，可以显

著上调 IL-4、IL-10 表达，下调 TNF-α、IL-6、IFN-γ 表

达，发挥抗炎作用[11]

。本试验探讨茵陈-大黄不同配比

对绿原酸和蒽醌类成分的影响，筛选出二者最佳配伍比

例。旨在为开发新药提供理论依据。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

大黄（亳州药材市场）、茵陈（亳州药材市场）、绿

原酸（长沙上禾生物科技有限公司，CAS 号：327-97-

9，纯度：HPLC>98%）、大黄酸（长沙上禾生物科技有

限公司，CAS 号：478-43-3，纯度：HPLC>98%）、芦荟

大黄酸（上海诗丹德标准技术服务有限公司，CAS号：

481-72-1，纯度：HPLC>98%）、大黄素甲醚（长沙上禾

生物科技有限公司，CAS 号：521-61-9，纯度：HPLC>

98%），色谱级甲醇、色谱级乙腈（天津市四友精细化

学品有限公司）。

高效液相色谱仪（Agilent Technologies）、高速离

心机（赛默飞世尔科技有限公司）、超声波清洗机（郑

州生元仪器有限公司）、色谱柱（常熟市双杰机器测试

仪器）、循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任

公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茵陈与大黄配伍的提取方法

1.2.1.1 水煎法

大黄后下：按茵陈-大黄质量比 1∶1、1∶2、2∶1 称

取药材，分别加入清水适量，浸泡30 min，茵陈先煎煮

20 min，再加入大黄煎煮 15 min，二煎后浓缩至溶液

中药材含量约为 1 g/mL，浓缩药液放入-20 ℃冷冻

保存。

茵陈-大黄同时下：混合浸泡茵陈与大黄30 min，

煎煮 40 min，过滤，滤液备用；滤渣中加入适量清水，

煎煮20 min，过滤，合并两次滤液，浓缩至溶液中药材

含量约为1 g/mL浓缩药液放入-20 ℃冷冻保存。

茵陈、大黄单味药的煎煮方法同茵陈-大黄同时

下的煎煮方法。

1.2.1.2 水煎醇沉法

取上述水煎法中大黄后下，茵陈、大黄同时下的

全部水煮液各一半，分成两份置于烧杯中，加入 95%

乙醇溶液适量，使溶液中乙醇最终浓度一份为 70%，

一 份 为 80%；静 置 48 h，抽 滤 ，回 收 乙 醇 ，沉 淀 放

入-20 ℃冷冻保存。

1.2.2 茵陈与大黄配伍中绿原酸与蒽醌类成分的含

量测定

1.2.2.1 绿原酸含量的测定

参照中华人民共和国兽药典二部茵陈项下含量

测定方法[12]

。

100

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

① 色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流

动相 ：乙腈∶0.1% 磷酸溶液=20∶80；检测波长：

327 nm；柱温：30 ℃；流速：1.00 mL/min；

② 对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品适量，

50%甲醇制成每毫升含绿原酸70 μg的溶液。

③ 供试品溶液的制备：将原药液按1∶5加入50%

甲醇，超声处理 30 min，3 000 r/min离心 10 min；吸取

1 mL 上清液置于 5 mL 容量瓶中，50% 甲醇定容，摇

匀，过滤，即得供试品溶液。

④含量测定：将对照品及供试品溶液注入液相色

谱仪检测，根据对照品峰面积和浓度计算含量。

1.2.2.2 蒽醌类成分的含量测定

参照中华人民共和国兽药典中大黄项下含量测

定方法[12]

。

① 色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动

相：甲醇∶0.1%磷酸溶液=85∶15；检测波长：254 nm；

柱温：30 ℃；流速：1.00 mL/min。

② 对照品溶液的制备：称量大黄素甲醚、大黄酸

及芦荟大黄素对照品加入50%甲醇充分溶解，制备成

混合对照品溶液(含大黄酸、芦荟大黄素32 μg/mL，大

黄素甲醚16 μg/mL)。

③ 含量测定：供试品溶液制备同绿原酸含量测

定样品处理方法，将样品注入液相色谱仪，根据样品

所测峰面积与对照品峰面积计算各成分含量。

1.2.3 统计与分析

所得试验数据均使用 GraphPad Prism 7 软件进

行统计学分析处理。**表示差异显著（P<0.05），ns表

示差异不显著（P>0.05）。

2 结果与分析

2.1 绿原酸成分含量测定结果

图1所示，水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、

2∶1三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后

下中测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药中折算后

绿原酸含量的理论值，且茵陈-大黄 1∶1 提取出绿原

酸的含量相较于其他组显著升高（P<0.05）。

如图2（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的

上清液中，茵陈-大黄1∶1、茵陈-大黄1∶2后下两种

配伍测定的绿原酸含量高于茵陈单味药折算后绿原酸

的含量的理论值；其余配伍所测定的绿原酸含量则均

低于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵

陈-大黄1∶1提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄

2∶1 以及茵陈-大黄 1∶1 后下、1∶2 后下、2∶1 后下

（P<0.05）。如图 2（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为

70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不

同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的绿

原酸含量均高于茵陈单味药折算后绿原酸含量的理

论值，且茵陈-大黄1∶1提取的绿原酸含量显著高于

其余组（P<0.05）。如图2（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓

度为 80% 时的上清液中，茵陈-大黄 1∶1 后下配伍测

定的绿原酸含量低于茵陈单味药折算后绿原酸的含

量的理论值；其余配伍所测定的绿原酸含量则均高于

茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵陈大黄1∶1提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄2∶1

以及茵陈-大黄 1∶1 后下、1∶2 后下、2∶1 后下（P<

0.05）。如图2（D）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时

的沉淀中，茵陈-大黄1∶2、2∶1后下两种配伍测定的

绿原酸含量低于茵陈单味药折算后的绿原酸含量的理

论值；其余配伍所测定的绿原酸含量均高于茵陈单味

药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵陈-大黄 1∶1

提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄 1∶2 以及茵

陈-大黄1∶1后下、1∶2后下、2∶1后下（P<0.05）。水煎原药液中绿原酸的含量

(mg/g)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

茵陈原药液

60

40

20

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量

**

折算后绿原酸含量理论值

注：“**”表示差异显著（P<0.05），ns 表示差异不显著（P>0.05）；下

图同。

图1 水煎原药液中绿原酸含量的测定结果

2.2 蒽醌类成分含量测定结果

2.2.1 水煎原药液中蒽醌类成分含量测定

如图3（A）所示：水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶

1 后下和 1∶2 后下两种配伍测定的大黄酸的含量低

于大黄单味药折算后大黄酸的含量的理论值；其余

4 种配伍中所测定的大黄酸的含量均高于大黄单味药

折算后大黄酸的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出大

黄酸含量显著高于其余组（P<0.05）。图3（B）所示：水

煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1三种不同

配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下中测定的芦

荟大黄素含量均高于茵陈单味药中折算后芦荟大黄

素含量的理论值，且茵陈-大黄 1∶1 后下、1∶2 后下

101

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

以及茵陈-大黄 1∶2 提取出芦荟大黄素含量显著高

于茵陈-大黄 1∶1（P<0.05）。图 3（C）所示：水煎法提

取液中，茵陈-大黄 1∶1 后下、1∶2 后下两种配伍测

定的总蒽醌成分含量低于大黄折算后总蒽醌成分含

量的理论值；而其余 4种配伍测定的总蒽醌成分含量

均高于大黄折算后总蒽醌含量的理论值，且茵陈-大

黄1∶2提取出总蒽醌含量显著高于除菌陈-大黄1∶

3之外的其余组（P<0.05）。

2.2.2 大黄酸结果测定

如图 4（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 70% 时

的上清液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1三种不同配

伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的大黄酸

含量均高于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值，

且茵陈-大黄 1∶1 提取出大黄酸含量显著高于其余

组（P<0.05）。图 4（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为

70%时沉淀中，茵陈-大黄 1∶1时测定的大黄酸的含

量高于大黄单味药折算后的大黄酸的含量理论值；其

余配伍比例所测定的大黄酸的含量则低于大黄单味

药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1提

取出大黄酸含量显著高于其余组（P<0.05）。图 4（C）

所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 80% 时的上清液中，茵

陈-大黄 1∶1、1∶2、2∶1 三种配伍测定的大黄酸含

量高于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值；而其

余 3 种配伍所测定的大黄酸的含量则均低于大黄单

味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄 1∶2

提取出大黄酸含量显著高于其余组（P<0.05）。图 D

所示：茵陈-大黄 1∶1、1∶2 后下两种配伍测定的大

黄酸含量低于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论

值；而其余 4种配伍测定的大黄酸含量则均高于大黄

单味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2

提取出大黄酸含量显著高于其余组（P<0.05）。

2.2.3 芦荟大黄素结果测定

如图 5（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 70% 时

的上清液中，茵陈-大黄 1∶1 后下、1∶2 后下两种配

伍测定的芦荟大黄素含量低于大黄单味药折算后芦

荟大黄素含量的理论值；而其余配伍所测定的芦荟大

黄素的含量则均高于大黄单味药折算后芦荟大黄素

含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1提取出芦荟大黄素

图2 绿原酸含量的测定结果

70

%上清液中绿原酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

茵陈上清液

800

600

400

200

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（A）

70

%沉淀中绿原酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

茵陈上清液

40

30

20

10

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（B）

80

%上清液中绿原酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

茵陈上清液

500

400

300

200

100

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（C）

80

%沉淀中绿原酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

茵陈上清液

20

15

10

5

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（D）

102

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

图4 大黄酸含量的测定结果

70

%上清液大黄酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄沉淀

150

100

50

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（A）

70

%沉淀大黄酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄沉淀

40

30

20

10

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（B）

80

%上清液大黄酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄沉淀

250

200

150

100

50

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（C）

80

%沉淀大黄酸含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄沉淀

25

20

15

10

5

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（D）

图3 水煎原药液中蒽醌类成分含量测定结果原药液中总蒽醌的含量

(mg/mL)

茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄原药液

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

25

20

15

10

5

0

**

绿原酸含量

折算后绿原酸含量理论值

（C）

水煎原药液中芦荟大黄素 的含量(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄原药液

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

2.0

1.5

1.0

0.5

0

**

绿原酸含量

折算后绿原酸含量理论值

（B）

水煎原药液中大黄酸的含量

(mg/mL)

茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄原药液

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

25

20

15

10

5

0

**

绿原酸含量

折算后绿原酸含量理论值

（A）

的含量显著高于除茵陈-大黄 1∶2 外的其余组（P<

0.05），与茵陈-大黄 1∶2 无显著差异（P>0.05）。图 5

（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 70% 时的沉淀中，

茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 3种不同配伍比例按照大

黄同时下以及大黄后下测定的芦荟大黄素的含量均

高于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值，且

茵陈-大黄 2∶1 提取出芦荟大黄素的含量显著高于

其余组（P<0.05）。图5（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为

80% 时的上清液中，茵陈-大黄 1∶1、1∶2、2∶1 3 种

不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的

103

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

芦荟大黄素含量均低于大黄单味药折算后芦荟大黄

素含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出芦荟大黄

素的含量显著高于其余组（P<0.05）。图 5（D）所示：

水煎醇沉法醇沉浓度为 80% 时的沉淀中，茵陈-大黄

1∶1、1∶2、2∶1三种不同配伍比例按照大黄同时下

以及后下测得的芦荟大黄素含量均高于大黄单味药

折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄 2∶1

提取出芦荟大黄素的含量显著高于其余组（P<0.05）。

注：大黄素甲醚在水煎醇沉法醇沉浓度为70%、80%的上清液、以及80%的沉淀中中均无峰值出现。

图5 芦荟大黄素含量的测定结果

70

%上清液芦荟大黄素含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

10

8

6

4

2

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（A）

70

%沉淀芦荟大黄素含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

15

10

5

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（B）

**

80

%上清液芦荟大黄素含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

250

200

150

100

50

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（C）

80

%沉淀芦荟大黄素含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

20

15

10

5

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（D）

2.2.4 总蒽醌成分含量测定

如图 6（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 70% 时

的上清液中，茵陈-大黄 1∶1、1∶2、2∶1 3种不同配

伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的总蒽醌

成分的含量均高于折算后总蒽醌成分含量的理论值，

且茵陈-大黄 1∶1 提取出总蒽醌含量显著高于其余

组（P<0.05）。图 6（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为

70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1和2∶1两种配伍测

定的总蒽醌成分的含量高于折算后总蒽醌成分的含

量的理论值；而其余 4种配伍测定的总蒽醌成分的含

量均低于折算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵

陈-大黄1∶1提取出总蒽醌含量显著高于其余组（P<

0.05）。图 6（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为 80% 时

的上清液中，茵陈-大黄 1∶2、2∶1 两种配伍测定的

总蒽醌成分的含量均高于折算后总蒽醌成分含量的理

论值；而其余四种配伍测定的总蒽醌成分含量均低于

折算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶

2提取出总蒽醌含量显著高于其余组（P<0.05）。图 D

所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的沉淀中，茵陈大黄 1∶1、1∶2、2∶1三种不同配伍比例按照大黄同

时下以及大黄后下测定的总蒽醌成分的含量均高于折

算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2

提取出总蒽醌含量显著高于茵陈-大黄2∶1的其余组

（P<0.05），与茵陈-大黄2∶1无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 茵陈-大黄药对不同配伍比例对绿原酸含量的

影响

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是一种酚酸类化

104

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

图6 总蒽醌成分含量的测定结果

70

%上清液总蒽醌的含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

200

150

100

50

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（A）

70

%沉淀总蒽醌的含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

40

30

20

10

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（B）

**

80

%上清液总蒽醌的含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

400

300

200

100

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值

**

（C）

80

%沉淀蒽醌的含量

(mg/mL)茵陈∶大黄1∶1

茵陈∶大黄1∶2

茵陈∶大黄2∶1

茵陈∶大黄1∶1后下

大黄上清液

30

20

10

0

茵陈∶大黄1∶2后下

茵陈∶大黄2∶1后下

绿原酸含量 折算后绿原酸含量理论值 **

（D）

ns

合物，由咖啡酸的 1 位羧基和奎尼酸的 3 位羟基缩合

而成，是植物细胞通过有氧呼吸经莽草酸途径合成的

一种苯丙素类物质，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保护肝

脏的作用。众多研究发现，添加 CGA 在提高猪的生

长性能、抗氧化能力、增强其机体免疫力以及肠道屏

障等方面有重要作用[6]

。王宇等[13]

研究发现，日粮中

添加 250、500、1 000 mg/kg CGA 后，断奶仔猪的小肠

指数和小肠绒毛/隐窝比均有所增加，肠道形态得到

改善。Chen 等[14]

研究表明，在日粮中添加 600 mg/kg

CGA可以通过抑制炎症反应、提高抗氧化能力和改变

盲肠微生物群组成来改善急性热应激损伤。

试验得出，在水煎提取法中，茵陈-大黄1∶1、1∶

2、2∶1三个不同配比按照大黄同时下以及大黄后下测

定的绿原酸含量均高于茵陈单味药的含量，且茵陈-大

黄配伍比例为 1∶1时测定的绿原酸含量最高。韩晋

等[15]

试验得出茵陈与大黄合煎后，绿原酸的含量提高，

本试验结果与此结果相似。因此，可以说明，在水煎法

提取工艺中，茵陈与大黄两者配伍后，对绿原酸的溶出

率均有促进作用，且最佳配比为茵陈-大黄1∶1。

在水煎醇沉提取方法中，醇沉浓度为70%时的沉

淀中，测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药的含量，

且茵陈-大黄配伍比例为 1∶1 时测定的绿原酸含量

最高。刘丽清等[16]

研究得出，绿原酸的最佳醇沉浓度

为 70%，该试验的结果显示醇沉浓度为 70%，提取绿

原酸的含量最高。因此，在水煎醇沉法提取工艺中，

茵陈与大黄两者配伍后，对绿原酸的溶出率均有促进

作用，且最佳配比为茵陈-大黄1∶1。

3.2 茵陈-大黄药的不同配伍比例对蒽醌类成分含

量的影响

蒽醌类成分是目前大黄中研究最多的活性成分，

同时也是大黄中的主要活性成分。芦荟大黄素是蒽醌

类成分之一。刘美艳等[17]

研究发现，芦荟大黄素可抑

制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等生长。

在水煎提取法中，茵陈与大黄配伍比例为 1∶1、

1∶2、2∶1时总蒽醌成分的含量高于大黄单味药的含

量，且茵陈-大黄配伍比例为1∶2时总蒽醌成分含量

最高；而茵陈-大黄配伍比例为1∶1后下和1∶2后下

时总蒽醌成分含量低于大黄单味药的含量，可能由于

105

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

大黄后下煎煮时间过短，蒽醌类成分没有完全溶出。

有研究表明，大黄中的结合型蒽醌及鞣质等成分均既

溶于水又溶于醇，但大黄中的游离型蒽醌及茵陈中具

有保肝活性的香豆素类成分极性较小，易溶于醇难溶

于水[18]

，因此我们要考虑后期的提取工艺。

在水煎醇沉提取方法中，醇沉浓度为70%时的上

清液中，茵陈-大黄的配伍为1∶1时总蒽醌成分测定

的含量最高。醇沉浓度为 70% 时的沉淀中，茵陈-大

黄1∶1时总蒽醌成分测定的含量最高。

醇沉浓度为 80%时的上清液中，茵陈-大黄 1∶2

时总蒽醌成分测定的含量最高。在醇沉浓度为 80%

时的沉淀中，茵陈-大黄的配伍为1∶2时总蒽醌成分

测定的含量最高。

由于在醇沉浓度为80%时，沉淀中的6个全部配

伍比例及上清液中同时下的 3 个配伍比例中的总蒽

醌成分的含量均增高，可以说明不同配伍比例及大黄

的加入时间对大黄蒽醌类成分的含量具有一定的影

响性，刘永涛等[19]

试验研究数据表明：大黄的泻下成

分蒽醌类成分在15~20 min达到最大值；因此，大黄加

入的时间也决定了蒽醌类成分的释放量。试验表明，

茵陈-大黄的配伍比例为1∶2时，提取到蒽醌类成分

的含量最高，这与张永红[20]

实验得出，大黄蒽醌类成

分的最佳醇沉浓度为80%，与试验结果相一致。

上述的试验结果表明，茵陈-大黄配伍后，无论是

采用水煎法亦或是水煎醇沉法，所得到的绿原酸和蒽

醌类成分的含量均高于单味药所得到的。由于传统中

药复方汤剂在使用上的不便等原因，近年来单味中药

精制颗粒开始用于临床。单味中药精制颗粒是将批量

的单味中药饮片分别加水煎煮、浓缩、干燥、分装。使

用时按处方混合；开水冲服即得，相当于中药汤剂的分

煎。传统中药汤剂是按方配药，加水共煎而得，即合

煎。分煎与合煎制得的汤剂，在其化学组成、药效和疗

效等方面有什么差别，是单味中药精制颗粒广泛用于

临床基础。分煎与合煎制得汤剂的药效学、临床疗效

方面已经有了一些报道。但有关其化学组成方面的报

道较少。本试验研究证明，茵陈-大黄配伍后，其内部

的有效成分均得到提高，但要注意二者的配伍比例，这

也间接地反映出配伍在中药方剂中的重要作用。

4 结论

茵陈、大黄配伍后绿原酸含量均有所提高，且水

煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶1；茵陈与

大黄配伍后蒽醌类成分含量也均有所提高，其中大黄

酸含量提高最为显著，且水煎法与水煎醇沉法的最佳

配伍比例均为1∶2。

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（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

106

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

卤虫（Artemia salina）是鱼、虾、蟹苗种培育过程 中广泛使用的一种高蛋白活性饵料，也是水生毒理学

常用的实验动物，卤虫卵与卤虫具有很高的经济价值

与科研价值[1]

。我国卤虫天然资源丰富，主要分布在

渤海湾盐田及西北部的青海、新疆、西藏等高原和盐

湖地区，但其应用开发起步晚，直到20世纪80年代中

期开始卤虫的增、养殖试验，国内卤虫养殖采用室外

滩涂、盐田盐湖等大面积粗放型养殖模式，受天气等

pH 对卤虫(Artemia saline)幼体急性毒性初步研究

■ 蒋 湘1，2 林文蔚1 许乐乐1，2 梁金荣1 叶海琴1 陈道海1，2 王锂韫1，2*

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048；

2.广东省粤西海鲜资源可持续利用工程技术研究中心，广东湛江 524048）

摘 要：采用半静水毒性试验法研究 pH 对卤虫（Artemia saline）幼体急性毒性及半致死毒性时

间。通过概率单位法分析pH对卤虫的半致浓度及半致死毒性时间，并估算回归方程与95%置信区间。

结果表明：pH对卤虫死亡数量有极显著影响（P<0.01），24、48 h的半致死pH及95%置信区间分别为：

5.031（4.791~5.261）、5.345（5.227~5.467），安全pH为6.50；对应H+

摩尔浓度分别为：9.311×10-6

、4.519×

10-6

、3.192×10-7

mol/L。pH4.8、5.2、5.6、6.0 的半致死时间及置信区间分别为 22.275（14.286~28.928）、

44.986（33.079~55.288）、89.813（79.244~100.231）、131.971（119.987~145.860）h。该研究为水质酸化对

卤虫养殖、卤虫的低pH的耐受性研究及海水养殖中的水质管理提供相关参考依据。

关键词：卤虫；pH；急性毒性；半致死时间；半致死pH

doi:10.13302/j.cnki.fi.2023.18.016

中图分类号：S816.32 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）18-0107-06

Preliminary Study on The Acute Toxicity of pH to Artemia saline

JIANG Xiang1,2

LIN Wenwei1

XU Lele1,2

LIANG Jinrong1

YE Haiqing1

CHEN Daohai1,2

WANG Liyun1,2*

(1. School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Guangdong Zhanjiang 524048,

China; 2. Western Guangdong Engineering Research Center on Sustainable Utilization of Seafood

Resources, Guangdong Zhanjiang 524048, China)

Abstract：This experiment researched on the acute toxicity and semi-lethal time of pH to Artemia saline

by the semi-hydrostatic toxicity test method. It analysed the semi-lethal concentration and toxicity time

for pH to Artemia Salina using Probability unit method, then estimated the regression equation and 95%

confidence interval. The results showed that pH had a extremely significant influence to Artemia salina

deaths. The semi-lethal pH value and 95% confidence interval of 24 h and 48 h were 5.031 (4.791-

5.261) and 5.345 (5.227-5.467), respectively, the safe pH value was 6.50, and the corresponding H+

mo⁃

larity was 9.311×10-6

mol/L, 4.519×10-6

mol/L, 3.192×10-7

mol/L, respectively. The semi-lethal time and

confidence interval of pH4.8, pH5.2, pH5.6 and pH6.0 were 22.275 (14.286-28.928) h, 44.986(33.079-

55.288) h, 89.813 (79.244-100.231) h, 131.971(119.9) h, respectively. The research provided a reference

for study on the tolerance of low pH for Artemia salina, and its cultured on seawater acidification and wa⁃

ter quality management on aquaculture.

Key words：Artemia saline; pH; acute toxicity; semi-lethal time; semi-lethal pH

作者简介：蒋湘，硕士，实验师，研究方向为海洋生物学。

*通讯作者：王锂韫，博士，教授。

收稿日期：2023-03-07

基金项目：湛江市海洋青年人才专项[2021E05024]

107

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

影响较大，产量低且不稳定，卤虫资源不能满足日益

增长的水产养殖业的需求[2-3]

。因此卤虫的养殖需由

捕捞向养殖、粗放养殖模式向工厂化养殖模式转变[4]

。

罗国芝等[5]

利用循环水系统中过滤的固体废弃物培养

成生物絮凝液用于卤虫的养殖与营养强化研究。王

振华等[6]

、刘文御[7]

研究表明在循环水养殖系统中 pH

会因为养殖动物所排放的 CO2以及附着池底滤料上

硝化细菌的硝化反应而导致水质酸化，pH 降低。低

至一定程度的pH会对水生动物生长发育产生不利的

影响。研究卤虫幼体对低pH的耐受性对开展循环水

工厂化养殖有一定的指导价值。

pH 是水产养殖中很关键的一个水质参数，直接

对水生动物的代谢机能产生影响。陶易凡等[8]

研究表

明pH胁迫影响甲壳动物的肝胰腺正常分泌与代谢活

动，引起肝胰腺功能紊乱；间接对水体中氨氮、亚硝酸

盐以及 Zn2+

、Cd2+

等的毒性产生显著影响[9-11]

，国内外

学者开展关于 pH 胁迫对凡纳缤对虾（Litopenaeusvan⁃

namei）死亡率与抗氧化酶基因表达[12-13]

、pH 对巴西

境内两种虾的幼体生长和发育的亚致死效应[14]

、凡纳

缤对虾（Litopenaeusvannamei）的免疫因子[15]

等研究。

从水生动物毒理学方向，以 pH 为主要环境因子对水

生动物的急性毒性研究的报告主要集中在对虾类。

梁彩凤等[16]

通过静水试验法研究低pH对日本囊对虾

（M.japonicas）的急性毒性，分析48、72、96 h半致死pH

与 pH 4.1、4.4、4.7 的半致死时间；杨富亿等[17]

研究日

本沼虾（Macrobrachiumnipponense）幼虾对碱度和 pH

的适应性，计算不同时间的半致死 pH 与安全 pH；么

宗利等[18]

采用静态急性毒理学方法，研究碳酸盐碱度

和pH对凡纳滨对虾（L.vannamei）仔虾存活率的影响；

王志飞等[19]

、白秀娟等[20]

等通过急性毒性方法研究pH

对秀丽高原鳅（Triplophysa venusta）与文昌鱼（Bran⁃

chiostomabelcheri）幼鱼急性毒性效应；而关于 pH对卤

虫幼体的急性毒性研究鲜有报道，仅见潘正军[21]

、杨

承忠等[22]

关于 pH 对卤虫卵孵化率的影响，Blust 等[23]

研究的在不同pH条件下卤虫对铜离子的生物利用率

的研究；马婷等[24-25]

研究 pH对卤虫无节幼体生长，体

脂肪酸，抗氧化指标的影响等。本研究以孵后72 h的

卤虫无节幼体为研究对象，通过半静水毒性试验法开

展不同 pH 梯度的急性毒性与同一 pH 下的毒性时间

研究，估算安全 pH 及 95% 置信区间和半致死毒性时

间，为循环水养殖条件下水质酸化对卤虫养殖及低

pH的耐受性研究和其他海水增养殖过程中的水质管

理提供相关参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

实验所用卤虫休眠卵为湛江海神生物科技发展有

限公司提供，经实验观察确定为孤雌生殖卤虫（Artemia

parthenogenetica of Tianjin），称取卤虫休眠卵 1 g 于

5 000 mL烧杯中，加入经处理后循环的海水2 000 mL，

全程充氧于 2 000 lx 光强度下孵化 28 h，调节氧量至

卤虫卵浮于水中即可，实验开始前检测循环水的理化

因子：pH7.8、溶解氧 7.99 mg/L、温度 26.7 ℃、盐度

26.9、亚硝酸盐 4.70 μg/L、氨氮 5.94 mg/L。实验所

用无节幼体为孵化后 72 h 的卤虫幼体。实验容器

为直径 11 cm、高 3 cm 圆柱形食品级塑料容器，有

效水体 200 mL。实验开始前配置 0.1mol/L HCl 溶

液 与 0.1 mol/L NaOH 溶液各 1 000 mL，通过 pH 计

(台湾衡欣 pH 测试笔 AZ8693）检测海水 pH。pH 调

节方法：取 1 000 mL 新鲜海水，计算出大约所需 HCI

溶液体积，通过往水中滴加 HCl溶液降低 pH，边加边

搅拌，当接近所需 pH 附近时，逐渐减少滴加量，直到

pH 变化值不超过 0.1，调节完成。实验过程中不充

气，可适当少量投喂饵料，包括虾片、螺旋藻混合液，

每隔一定时间检测溶液 pH，并换新鲜的实验液保持

pH稳定。

1.2 实验设计

预实验按水生动物毒理学试验方法开展[26-27]

，通

过查阅文献资料设置pH分别为3、4、5、6、7、8，共6个

实验组，每个梯度2个重复组，每组放卤虫幼体30只，

进行48 h急性毒性实验，找到卤虫的24 h全死亡最高

pH 和 48 h 全存活最低 pH。死亡卤虫幼体判断标准

为：幼体沉于底部，碰触附肢10 s不动。

正式实验：根据预实验结果设置 pH 分别为 4、

4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、8.0，共7个实验组，其中pH8.0为

对照组，每个实验组设置 3 个重复组，每个实验组随

机挑选活力正常的卤虫幼体 30 只进行实验，于实验

开始后6、12、24、48 h观察幼虫的活动状态，统计死亡

幼体数量并用吸管吸出死亡幼体，统计所有实验组的

死亡数量平均值。在开展不同pH对卤虫急性毒性实

验同时，对 pH 为 4.8、5.2、5.6、6.0 的实验组开展半致

死毒性时间的实验，观察卤虫在 4 种不同低 pH 溶液

中的耐受性，实验持续时间为192 h，每天记录实验组

的存活情况，检测溶液的pH，更换新鲜等pH的海水，

并滴加适当饵料混合液，吸出死亡个体做好记录。

108

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

1.3 数据分析

用SPSS 21.0软件处理数据，Probit回归法建立概

率单位-pH或实验时间的回归方程，对回归参数检验

采用 Z-Test，通过 Pearson's chi-squared test 检验回归

方程的拟合效果，绘制出 pH 与概率单位的散点图并

添加回归直线，以估算半致死pH、半致死毒性时间及

95%置信区间，实验中对照组出现死亡的数据校正方

法根据公式校正[27]

。

p=p' - c

1 - c

式中：p'——观察死亡百分数；

c——对照死亡百分数；

p——校正后的死亡百分数。

安全浓度（Sc）公式：Sc=48hLC50 × 0.3

( ) 24hLC50

48hLC50

2 求得[26]

。

2 结果与分析

2.1 pH对卤虫毒性实验结果

由图 1 所示，实验范围内随着 pH 升高死亡数量

减少。结果得到：pH4.0、4.4实验组在6 h绝大部分个

体死亡，pH4.8及以上的组大部分个体游动正常；24 h

时 pH4.8、5.2 大部分平行组个体活力较差，表现为游

动速率变小，附肢摆动频率减慢，部分个体沉在容器

底部摆动附肢直至死亡，死亡个体体色较深；pH5.6、

6.0 有少量死亡个体；48 h 时，pH5.6、6.0 死亡数量增

加但并未过半，通过对24 h与48 h死亡个体数量进行

配对样本t检验发现2个时间点的死亡数量有极显著

差异（P<0.01），对照组pH8.0有1个死亡个体；pH4.8~

6.0实验组的半致死毒性时间研究结果如图2所示，相

同pH下，随着毒性时间延长死亡数量增加，死亡速率

前期快后期慢，从死亡数据得出pH4.8、5.2全死亡时间

分别为 96、120 h；pH5.6、6.0过半死亡时间分别为 96、

120 h，直到192 h时的死亡数量分别为：（28.00±1.00）、

（22.67±3.51）个。GLM 分析结果得到 pH 与实验时间

及其交互效应对死亡数量均有极显著影响（P<0.01）。

24 h死亡数量

48 h死亡数量

死亡均值(个)

4.0 4.8 5.2 5.6 8.0

30.00

20.00

10.00

0 4.4 6.0

pH

图1 不同pH值对卤虫幼体的毒性实验结果

4.80

5.20

5.60

6.00

死亡数量(个)

6 48 72 96 192

30.00

20.00

10.00

0 24 120 144 168

pH

实验时间（h）

图2 急性毒性实验时间对卤虫死亡数量影响

2.2 死亡率随pH变化的拟合曲线

由图 3 所示，线 1、2 为 24 h 观测与期望死亡率，

线 3、4 为 48 h 观测与期望死亡率曲线，拟合曲线随

浓度变化先呈逐渐递减趋势而后平稳，近似反 S 曲

线，Probit 非线性回归通过利用累积标准正态分布函

数来拟合浓度对数-死亡率变化，24、48 h 的观测值

与期望值曲线相互交错，一致延伸，说明拟合效果

较好。24、48 h 期望值与观测值的卡方检验结果分

别 为 ：x24 h

2

=8.918，x48 h

2

=1.632；P=0.112，P=0.897，期

望值与观测值无统计学上显著差异。利用概率单位

Probit 转换，将期望概率（0，1）值转换为在实数范围

概率单位值，由此得到概率单位值-浓度对数回归

曲线，估算 pH 对卤虫无节幼体的 24、48 h 的半致死

浓度。

2.3 概率单位回归分析结果

pH对卤虫急性毒性及半致死毒性时间的概率单

109

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

位法分析结果如表 1、表 2、表 3所示，从表 1中得到不

同 pH 与不同实验时间的回归直线及其参数估计值、

参数估计标准误、参数显著性检验、95%置信区间等。

所有参数检验均达到极显著性水平（P<0.01）。表2中

显示 pH 与实验时间的概率回归拟合度卡方检验表，

卡方值均大于0.05，表明回归直线能较好的拟合实验

数据，观测值与期望值差异控制在可接受的范围内，

回归方程可信度高。pH的半致死量估计值与置信区

间如表 3所示，24、48 h的半致死 pH及 95%置信区间

分别为：5.031（4.791~5.261）、5.345（5.227~5.467），安

全 pH 为 6.50；对应 H+

摩尔浓度分别为：9.311×10-6

、

4.519×10-6

、3.192×10-7

mol/L。在 pH 不低于 6.50的水

体中养殖卤虫是最低的水质标准。不同pH条件下的

半致死时间分析结果得到：pH4.8 的半致死时间为

22.275（14.286~28.928） h、pH5.2 的 半 致 死 时 间 为

44.986（33.079~55.288） h、pH5.6 的 半 致 死 时 间 为

89.813（79.244~100.231） h、pH6.0 的 半 致 死 时 间 为

131.971（119.987~145.860） h。

4.0 4.4 4.8 5.2 8.0

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0

观测死亡率24 h

期望死亡率24 h

观测死亡率48 h

期望死亡率48 h

5.6 6.0

死亡率

pH

图3 死亡率随pH暴露浓度变化的拟合曲线

表1 不同pH与实验时间的概率单位回归参数及置信区间估计

项目

pH24 h

pH48 h

pH=4.8

pH=5.2

pH=5.6

pH=6.0

参数

斜率

截距

斜率

截距

斜率

截距

斜率

截距

斜率

截距

斜率

截距

估计

-1.959

9.855

-2.199

11.752

0.041

-0.911

0.020

-0.900

0.017

-1.572

0.015

-1.957

标准误

0.238

1.208

0.287

1.531

0.007

0.233

0.003

0.191

0.002

0.187

0.002

0.213

Z

-8.236

8.157

-7.661

7.678

6.149

-3.906

6.701

-4.704

9.826

-8.396

8.757

-9.193

Sig.

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

0.000

95%置信区间

下限

-2.425

8.647

-2.761

10.221

0.028

-1.144

0.014

-1.091

0.014

-1.759

0.012

-2.170

上限

-1.493

11.063

-1.636

13.282

0.054

-0.678

0.026

-0.709

0.021

-1.384

0.018

-1.744

注：“Z”表示单个参数进行的Z-Test法；

表2 pH与实验时间的概率回归拟合度卡方检验

项目

pH

pH=4.8

pH=5.2

pH=5.6

pH=6.0

实验时间(h)

24

48

192

192

192

192

卡方值

8.918

1.632

0.775

3.953

6.041

1.836

df

5

5

3

4

7

7

Sig.

0.112

0.897

0.855

0.412

0.535

0.968

3 讨论

3.1 低pH对卤虫幼体生长与发育的影响

pH 是水产养殖中的一个关键的水质参数，通常

认为水产养殖的适宜水体为弱碱性水质，过低的 pH

会直接影响到养殖动物生长发育与繁殖，甚至引起大

量死亡[28]

。Blust等[23]

在研究不同pH条件下卤虫对铜

离子的生物利用率，设置 2个的 pH 范围分别为 5.37~

6.62、6.78~8.34，结果得到 5.37~6.62 的实验组卤虫对

铜离子利用率显著低于 6.78~8.34 的实验组；生长方

面的实验表明，低 pH 会影响到卤虫对铜离子的生物

利用率。潘正军等[21]

研究 pH6.0~10.0 范围内对西藏

大红卵孵化率的影响，结果得到 pH6.0的实验组孵化

率显著低于pH8.0孵化率的影响，pH7.0与pH8.0的孵

化率无显著差异；Sui等[29]

研究4个pH水平（5、6、7、8）

对渤海湾卤虫、旧金山卤虫与越南人工培育卤虫三个

产地卤虫的孵化率、存活率与繁殖性能的影响，结果

得到当 pH为 5时，孵化率显著低于 pH8组，无节幼体

48 h 存活率为 0，并且 3 个品系的卤虫均无法正常繁

殖；相同的实验时间pH7、pH8的存活率显著高于pH6

组；杨承忠等[22]

以巴里坤湖卤虫为研究对象，结果表

明 pH5 组不能孵化，pH6 组无节幼体存活率显著低

110

SILIAO GONGYE 2023年第44卷第18期 总第687期

pH7、pH8 组。本研究结果得到 24、48 h 半致死 pH 分

别为 5.031、5.345，安全 pH 为 6.50，与 Blust 等[23]

研究

所确定适宜与非适宜 pH 范围基本上相符，在高于

pH6.5（pH6.78~8.34）的海水中，更有利于卤虫对铜离

子的生物利用；Bsua等[30]

研究证实在 pH6.3以下的海

水中卤虫卵的呼吸受抑制进入无氧休眠状态，潘正

军等[21]

、杨承忠等[22]

与 Sui 等[29]

研究得到低于 pH6 实

验组的孵化率显著降低或不能孵化。杨承忠等[22]

、

Sui等[29]

研究都得到 pH7、8 组的存活率显著高于 pH6

组，林小涛等[31]

研究证明：当水体pH低于或高于某一

范围时，甲壳动物的呼吸运动受抑制，耗氧率降低。

所以在低于 pH6.5 的海水中，卤虫幼体会受到 pH 的

毒性作用导致呼吸受抑制，存活率偏低，这与本研究

的结论基本一致。

3.2 卤虫幼体对低pH的耐受性及半致死时间

Han 等[32]

研究表明，低 pH 会破坏水生动物体内

血液酸碱平衡，从而导致有效载氧量减少，引起缺氧，

尤其明显减缓甲壳类动物的矿化作用。从水生动物

毒理学方向开展 pH 对卤虫毒性研究报告较少，但对

其它种类的甲壳动物如对虾的研究较多。梁彩凤

等[16]

研究pH对日本囊对虾（M.japonicus）急性毒性，得

到安全 pH 为 5.435；陶易凡等[8]

研究得到克氏原螯虾

（Procambarusclarkii）的安全 pH 为 4.675；杨富亿等[17]

通过急性毒性法得到日本沼虾幼虾的安全pH范围为

5.26~8.67；Furtado 等[33]

得到凡纳缤对虾（L.vannamei）

对虾幼体的安全 pH 为 5.04；于天基等[34]

研究脊尾白

虾（Exopalaemon carinicauda）的安全pH为5.78。而本

研究得到卤虫幼体的安全 pH 为 6.50，高于以上所有

研究得到的安全pH，卤虫对低pH的耐受性明显低于

对虾类，猜测这是卤虫与对虾的生理结构复杂程度及

逆境调控机制差异导致。我国海水渔业水质标准GB

11607—1989 所规定的 pH 指标 7.0~8.5，因此卤虫幼

体对低pH敏感性对循环水条件下卤虫养殖及水质管

理提供一定的参考价值。

半致死时间是研究水生动物在极端环境因子中

耐受程度的一个关键指标[35]

。梁彩凤等[16]

研究得到

日本囊对虾在 pH4.1、4.4、4.7条件下的半致死时间分

别为58.281、93.771、139.549 h；李春涛等[36]

研究pH对

离体新棘衣棘头虫（Neosentiscelatus）的毒性，在 pH4、

5、6、7、8 条件下的半致死时间分别为 4.2、18.5、3.8、

2.8、2.1 h；高焕等[37]

研究逆境环境条件对三疣梭子蟹

幼蟹(Portunustrituberculatus)致死效应 ，设置 pH6.0、

6.5、9.0、9.5，结果表明幼蟹的半致死时间为0.09~15 h，

碱性条件下存活时间要长于酸性条件下，以上研究可

以反映水生动物对不同 pH 的耐受性，尚未见到关于

pH 对卤虫的半致死时间的研究报道，本研究得到

pH4.8、5.2、5.6、6.0 下的半致死时间分别为 22.275、

44.986、89.813、131.971 h，从半致死时间可以推出卤

虫对低 pH 耐受性要低于日本囊对虾，高于新棘衣棘

头虫、三疣梭子蟹幼蟹，随着 pH 的升高，半致死时间

逐渐变长，pH 对卤虫幼体的毒性在减弱。本研究为

开展卤虫耐低pH品系选择及亚甲壳动物的抗逆性研

究提供参考数据与方法。另外统计分析发现不同pH

下的24、48 h的死亡数量有显著差异，但是GLM分析

得到在实验后期144、168、192 h三个时间点的死亡数

量无显著差异，实验过程中更换试剂液以保持 pH 稳

定，猜测pH的毒性效应集中前48 h内，而在实验后期

卤虫对pH产生了一定的适应性，因而死亡速率变慢，

其应对的调节机制尚不清楚有待进一步研究。

参考文献

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项目

pH

pH=4.8

pH=5.2

pH=5.6

pH=6.0

实验时间(h)

24

48

192

192

192

192

95%的置信区间

估计值

5.031（9.311×10-6

mol/L）

5.345（4.519×10-6

mol/L）

22.275 h

44.986 h

89.813 h

131.971 h

下限

4.791

5.227

14.286 h

33.079 h

79.244 h

119.987 h

上限

5.261

5.467

28.928 h

55.288 h

100.231 h

145.860 h

安全pH(H+

浓度/mol/L)

-

6.50（3.192×10-7

mol/L）

表3 半致死量估计值与置信区间

111

问 题 探 讨 2023年第44卷第18期 总第687期

(3): 350-356.

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（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

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