热带作物学报

2022 年 5 月 第 43 卷 第 5 期

（月刊 1980 年创刊）

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中国科学技术协会

主办单位

中国热带作物学会

中国热带农业科学院

中国科技出版传媒股份有限公司

承办单位

中国热带农业科学院科技

信息研究所

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主 编 邹学校 郭安平

副主编 蒋跃明 缪卫国

彭 政 徐明岗

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编 委（按姓名拼音排序）

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陈昆松 陈松笔 陈业光

陈业渊 戴好富 戴雄泽

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孔垂华 赖钟雄 雷朝云

李从发 李富生 李洪雯

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刘国道 彭 明 盛 军

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责任编辑 黄东杰 白 净

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CHINESE JOURNAL OF

TROPICAL CROPS

(Monthly, established in 1980)

May 2022, Vol. 43, No. 5

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Crops

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热带作物学报

2022 年 5 月 第 43 卷 第 5 期 （月刊 1980 年创刊）

目 次

组学与生物技术

木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究

................................................................................................................................周 锴，安飞飞，李开绵，陈松笔（871）

基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 ................ 董 晨，李金枝，郑雪文，王 弋，李伟才（882）

‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究............................................刘林芝，欧阳欢，李兴涛，陈健美（893）

橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定

.................................................................................................王 丹，徐兵强，孙 勇，彭存智，常丽丽，仝 征（904）

Bph36 介导的抗性机制及相关信号通路的研究 .................................................................................. 薛艳霞，李容柏（915）

油莎豆块茎油脂积累相关基因 CeWRI1 的克隆与功能分析

................................................................................. 徐 硕，邹 智，肖艳华，张 丽，孔 华，郭静远，郭安平（923）

种质资源与遗传育种

80 份陆稻晚稻农家种资源的遗传多样性综合分析............ 徐志军，李亚波，欧阳红军，徐 磊，安东升，刘 洋（930）

6 个引进油棕品种农艺性状评价 ..........................................................................................冯美利，张海清，曹红星（940）

腰果品种 DUS 测试指南的研制..............................................张中润，黄伟坚，黄海杰，肖丽燕，高 玲，徐 丽（948）

西番莲不同种质资源抗寒性测定...........................................................................郭玉琳，吴凤禅，李安定，蔡国俊（955）

四倍体白掌新品种‘绿萌’的选育........................................ 周辉明，林辉锋，莫智龙，陈昌铭，曹奕鸯，熊 君（964）

作物栽培与生理生化

10 份柠檬种质花粉形态观察 ..................................................................林秋金，王龙平，谢晓清，王美盛，林秀香（971）

杜鹃红山茶芽苗砧嫁接亲和性生理研究 .................李先民，黄展文，卢家仕，崔学强，苏 群，李春牛，卜朝阳（978）

栽培奇楠的显微结构研究 ....................................................... 刘欣怡，王露露，袁靖 ，梅文莉，戴好富，王 喆 军（986）

朱砂根和红凉伞花器官的形态补充描述 ............................................. 艾星梅，赵财宝，刘昕岑，谢 欢，孙媛媛（1001）

植物保护与生物安全

中国“槟榔黄化病”研究 40 年——病原、防控措施新进展

................................................................................ 唐庆华，孟秀利，于少帅，林兆威，牛晓庆，宋薇薇，覃伟权（1010）

抗氧化酶和植物螯合肽对苎麻重金属 Cd 胁迫的应答

................................................................................全芮萍，陈建福，张 蕾，许明志，杨瑞芳，佘 玮，崔国贤（1023）

协同作物提质增效和土壤地力提升的最佳氮素有机替代比例探索——以攀枝花芒果为例

................................................................................周维杰，李钟 ，李婷玉，巫和义，刘 淏 斌，高 伟，阮云泽（1032）

采后处理与质量安全

基于主成分分析法评价不同产地香牙蕉的营养品质.......................... 戎 瑜，王明月，吕岱竹，宋 佳，马 晨（1045）

3 种不同萃取方法对黑胡椒香气物质的气质联用分析

................................................................................王 珏，钟壹鸣，孙也乔，胡丽松，伍宝朵，郝朝运，范 睿（1055）

基于 UPLC-Q-TOF-MS 技术的益智种子和果皮成分分析 ...王茂媛，王祝年，王清隆，羊 青，张 旻 ，晏小霞（1064）

不同茶树品种制作美人茶的品质评价..... 庄明珠，李代胜，涂育东，李鹏春，闫佳伟，何春梅，陈美霞，金 珊（1076）

渗糖方式对加应子果脯营养、香气及果肉结构的影响 ...................... 沈雪玉，陈日辉，林钰婷，陈重光，黄 苇（1085）

CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS

May 2022 Vol. 43 No. 5 (Monthly, established in 1980)

CONTENTS

Omics & Biotechnology

Changes of -carotene and Protein Accumulation and Proteomic Analysis of Chromoplasts in Different Developmental Stages

of Cassava Tuberous Roots

.....................................................................................................................ZHOU Kai, AN Feifei, LI Kaimian, CHEN Songbi（871）

Transcriptome-wide Identification and Analysis of UBC Gene Family in Litchi chinensis Sonn.

............................................................................................. DONG Chen, LI Jinzhi, ZHENG Xuewen, WANG Yi, LI Weicai（882）

Physiological and Transcriptome Analysis of ‘Gannan Zao’ Navel Orange under Drought Stress

..........................................................................................................LIU Linzhi, OUYANG Huan, LI Xingtao, CHEN Jianmei（893）

Comparative Proteomics Analysis and Identification of Phosphorylated Protein in Latex of Rubber Tree Clones PR107 and CATAS8-79

.............................................................WANG Dan, XU Bingqiang, SUN Yong, PENG Cunzhi, CHANG Lili, TONG Zheng（904）

Bph36-mediated Resistance Mechanism and Related Signal Pathways ........................................... XUE Yanxia, LI Rongbai（915）

Cloning and Functional Characterization of CeWRI1, a Gene Involved in Oil Accumulation from Tigernut (Cyperus esculentus

L.) Tubers

....................................................XU Shuo, ZOU Zhi, XIAO Yanhua, Zhang Li, KONG Hua, GUO Jingyuan, GUO Anping（923）

Germplasm Resources, Genetics & Breeding

Comprehensive Genetic Diversity Analysis of Eighty Late Upland Rice Landrace

........................................................................ XU Zhijun, LI Yabo, OUYANG Hongjun, XU Lei, AN Dongsheng, LIU Yang（930）

Evaluation of Agronomic Traits of Six Imported Oil Palm Varieties.......... FENG Meili, ZHANG Haiqing, CAO Hongxing（940）

Development of Test Guideline of Distinctness, Uniformity and Stability for Cashew (Anacardium occidentale L.)

....................................................... ZHANG Zhongrun, HUANG Weijian, HUANG Haijie, XIAO Liyan, GAO Ling, XU Li（948）

Cold Resistance Determination of Different Passiflflora edulis Germplasm Resources

...................................................................................................................GUO Yulin, WU Fengchan, LI Anding, CAI Guojun（955）

Breeding a New Tetraploid Spathiphyllum floribundum ‘Lvmeng’ Variety

.................................................ZHOU Huiming, LIN Huifeng, MO Zhilong, CHEN Changming, CAO Yiyang, XIONG Jun（964）

Plant Cultivation, Physiology & Biochemistry

Observation on Pollen Morphology of 10 Lemon GermplasmsObservation on Pollen Morphology of 10 Lemon Germplasms

....................................................................LIN Qiujin, WANG Longping, XIE Xiaoqing, WANG Meisheng, LIN Xiuxiang（971）

CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS

May 2022 Vol. 43 No. 5 (Monthly, established in 1980)

Physiological Study on Grafted Affinity of Camellia azalea with Different Species Bud Seedling Rootstocks

..........................................LI Xianmin, HUANG Zhanwen, LU Jiashi, CUI Xueqiang, SU Qun, LI Chunniu, BU Zhaoyang（978）

Microstructure Research of Agarwood from Cultivated “Qinan” trees

....................................................................... LIU Xinyi, WANG Lulu, YUAN Jingzhe, MEI Wenli, DAI Haofu, WANG Jun（986）

Supplementary Description of Floral Morphology of Ardisia crenata and A. crenata Sims. var. bicolor (Primulaceae)

.................................................................................... AI Xingmei, ZHAO Caibao, LIU Xincen, XIE Huan, SUN Yuanyuan（1001）

Plant Protection & Bio-safety

Forty Years of Research on “Yellow Leaf Disease of Areca Palm” in China: New Progress of the Casual Agent and the Management

................................TANG Qinghua, MENG Xiuli, YU Shaoshuai, LIN Zhaowei, NIU Xiaoqing, SONG Weiwei, QIN Weiquan（1010）

Responses of Ramie to Antioxidant Enzymes and Plant Chelating Peptides to Cd Stress

................................. QUAN Ruiping, CHEN Jianfu, ZHANG Lei, XU Mingzhi, YANG Ruifang, CUI Guoxian, SHE Wei（1023）

Optimal Nitrogen Organic Replacement Ratio for Synergistic Crop Quality and Efficiency Enhancement and Soil Fertility

Enhancement-Taking Panzhihua Mango as an Example

........................................................ ZHOU Weijie, LI Zhonghao, LI Tingyu, WU Heyi, LIU Bin, GAO Wei, RUAN Yunze（1032）

Post-harvest Treatment & Quality Safety

Evaluation of Nutrition and Quality of Banana from Different Producing Areas Based on Principal Component Analysis

..........................................................................................RONG Yu, WANG Mingyue, LYU Daizhu, SONG Jia, MA Chen（1045）

Analysis of Aroma Substances in Black Pepper by Three Different Extraction Methods by GC-MS

....................................... WANG Jue, ZHONG Yiming, SUN Yeqiao, HU Lisong, WU Baoduo, HAO Chaoyun, FAN Rui（1055）

UPLC-Q-TOF-MS Based Analysis of Chemical Constituents of Seeds and Peels of Alpinia oxyphylla

.................................... WANG Maoyuan, WANG Zhunian, WANG Qinglong, YANG Qing, ZHANG Min, YAN Xiaoxia（1064）

Quality Evaluation of Beauty Tea Produced by Different Tea Varieties

..................... ZHUANG Mingzhu, LI Daisheng, TU Yudong, LI Pengchun, YAN Jiawei, HE Chunmei, CHEN Meixia, JIN Shan（1076）

Effects of Sugar Permeability Methods on Nutrition, Aroma and Structure of Candied Prunes

........................................................................ SHEN Xueyu, CHEN Rihui, LIN Yuting, CHEN Chongguang, HUANG Wei（1085）

CN 46-1019/S*1980*m*A4*224*zh*P*¥50.00*300*23*2022-5

热带作物学报 2022, 43(5): 871881

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-01-20；修回日期 2022-01-25

基金项目 国家自然科学基金面上项目（No. 31871687）。

作者简介 周 锴（1989—），女，硕士，研究方向：木薯蛋白质组学。*通信作者（Corresponding author）：陈松笔（CHEN

Songbi），E-mail：songbichen@catas.cn。

木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色

体蛋白质组学研究

周 锴1,2，安飞飞2

，李开绵2

，陈松笔2*

1. 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部木薯种质资源

保护与利用重点实验室，海南海口 571101

摘 要：木薯是世界重要的粮食作物，在我国发展潜力巨大。蛋白质和类胡萝卜素是重要的营养品质特性，但木薯蛋

白质含量低，提高木薯块根类胡萝卜素和蛋白质含量，提高其营养成分，已成为木薯选育种的重要目标。本研究以蛋

黄木薯（‘SC9’）、紫叶黄心木薯（‘BGM019’）和白心面包木薯（‘SC101’）3 个木薯品种为试验材料，开展黄心和白

心木薯块根营养品质特性的研究，分析其不同发育期类胡萝卜素和蛋白质含量的变化，同时利用双向电泳和质谱法开

展木薯块根有色体亚细胞结构蛋白质组的研究，揭示其蛋白质含量提高与类胡萝卜素积累的关联性。结果表明：3 个木

薯品种块根-胡萝卜素含量在块根形成期、膨大期和成熟期差异显著（P<0.05），‘BGM019’和‘SC9’蛋白质含量在

同一生长发育时期差异不显著（P>0.05），但显著高于‘SC101’（P<0.05）。随着木薯块根发育成熟，其类胡萝卜素和

蛋白质含量均呈上升趋势，且二者表现为正相关。以膨大期为对照，在‘SC9’成熟期块根有色体中检测到 36 个差异

表达蛋白质，其中 26 个上调表达，10 个下调表达；‘BGM019’中检测到 49 个差异表达蛋白质，其中 28 个上调表达，

21 个下调表达；‘SC101’检测到 38 个差异蛋白质，其中 20 个上调表达，18 个下调表达。通过对上述差异蛋白质的功

能分析，发现它们均参与抗氧化、碳代谢和能量代谢、信号转导等多个代谢过程，说明木薯块根类胡萝卜素积累是由

多个代谢途径协同作用的结果。对比分析 3 个木薯品种块根有色体亚细胞结构的差异蛋白质，发现 20 个差异表达蛋白

质在其中 2 个品种或 3 个品种间出现相同的表达趋势。它们主要涉及到碳代谢及能量代谢、抗氧化、细胞骨架蛋白、

无机离子运输及代谢、分子伴侣和蛋白质合成等代谢途径，其中与抗氧化相关的蛋白质占 20%。构建蛋白质生物调控

网络揭示块根有色体蛋白质与 β-胡萝卜素积累的关联性，为培育优质高营养的木薯新品种提供新思路。

关键词：木薯块根；蛋白质含量；-胡萝卜素含量；有色体；蛋白质组学

中图分类号：S533 文献标识码：A

Changes of -carotene and Protein Accumulation and Proteomic

Analysis of Chromoplasts in Different Developmental Stages of Cassava Tuberous Roots

ZHOU Kai1,2, AN Feifei2

, LI Kaimian2

, CHEN Songbi2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute,

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Ministry of Agriculture and Rural Affairs for Germplasm

Resources Conservation Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

Abstract: Cassava is one of the most important crops in the world and has a great potential as food crop in China. Protein and carotenoids are important nutritional quality characteristics. The content of protein in the cassava tuberous root

is low. Hence, to improve the carotenoid and protein content and the value nourishment of the tuberous root is an im-

872 热带作物学报 第 43 卷

portant goal for cassava breeding. In the present study, three cassava varieties including yellow cassava ‘SC9’,

‘BGM019’ and white cassava ‘SC101’ were selected to analyze the nutritional quality characteristics, and measure the

change of -carotene and protein content at different developmental stages of cassava tuberous roots. Additionally, 2-DE

in combination with mass spectrometry were used to analyze the proteome profile of the chromoplast in order to understand the coupling mechanism of increasing the protein content related with carotenoid accumulation. The results

showed that there were significant differences (P<0.05) between the genotypes in β-carotene content in the periods of

formation, enlargement and maturation of cassava tuberous roots. There were no significant differences (P>0.05) between ‘SC9’ and ‘BGM019’ regarding the protein content of tuberous roots, however, the protein contents in both yellow cassava genotypes weresignificantly higher than that of ‘SC101’ (P<0.05). A positive correlation between the carotenoid and protein content was observed during the development of the tubers in the genotypes. The tuberous-root

chromoplasts of enlargement period were used as references, proteome profile of tuberous-root chromoplast in maturation period revealed a total of 36 protein spots in ‘SC9’, in which 26 were classified as up-regulated and 10

down-regulated, while in ‘BGM019’, 49 differential proteins were identified with 28 up-regulated spots and 21

down-regulated, and in ‘SC101’ 38 differential proteins identified, in which 20 were up-regulated and 18 were

down-regulated. Most of the identified differential proteins were found to be involved in carbon and energy metabolism,

detoxifying and antioxidant and signal transduction mechanism. The results indicate that the accumulation of proteins

and carotenoid in cassava storage roots is regulated by different proteins complex. There were 20 common proteins observed between or among the genotypes. The proteins played the same expression pattern and were related to carbon and

energy metabolism, detoxifying and antioxidant, structure, inorganic ion transport and metabolism, chaperones and protein biosynthesis. The protein biological regulatory network was constructed and revealed the relationship of protein

content and -carotene accumulation in chromoplast of tuberous root, and would provide a new clue for the selection of

new cassava varieties with high quality and high nutrition.

Keywords: cassava tuberous roots; protein contents; -carotene content; chromoplasts; proteome

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科

（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）植物，是世

界第六大粮食作物。食用木薯风味独特，然而相

比其他谷类作物（蛋白质占干重 7%~14%），木薯

蛋白质含量低，一般为干重的 0.7%~2.5%，造成

许多以木薯为主食的非洲国家青少年营养不良、

生长发育迟缓、免疫力下降等。目前在我国的粮

食作物中，木薯占比很低，食用性能差的木薯粗

粮逐步向饲料、淀粉加工和生产能源酒精转移，

但随着我国经济的快速发展，人们生活水平不断

提高，与其他山珍野菜一样，木薯又以营养美味

的粗粮杂粮形式，逐渐回归人们的餐桌。目前中

国热带农业科学院已培育出块根富含-胡萝卜素

的蛋黄木薯和紫叶黄心木薯等品种，其块根蛋白

质含量显著高于普通白心木薯，因此，木薯作为

粮食作物和低糖、高能、美味的特色食品又重新

成为人们关注的焦点。

木薯块根中有色体是-胡萝卜素的载体，但

关于-胡萝卜素在蛋黄和紫叶黄心木薯有色体中

的高积累与有色体是否也可能作为蛋白质积累的

载体目前仍不很清楚。研究发现块根中造粉体可

以向有色体转变，但对造粉体向有色体转变的调

控知之甚少。而从基因表达到最终合成蛋白质，

很多因素会影响并改变蛋白质的功能，如蛋白质

翻译的调控、糖基化、磷酸化等，因此直接研究

蛋白质的变化意义无法替代。而采用蛋白质组学

技术能够对块根内淀粉体向有色体转变以及类胡

萝卜素积累过程中的蛋白质调控网络有广泛而完

整的认识，找到关键蛋白质，有利于揭示类胡萝

卜积累的机理[1]。

本研究选用蛋黄木薯（‘SC9’，-胡萝卜素

和蛋白质含量高）、紫叶黄心木薯（‘BGM019’，

-胡萝卜素含量中等）和白心面包木薯（‘SC101’，

-胡萝卜素含量低）块根及有色体为研究对象，

研究木薯块根不同生长发育时期-胡萝卜素和蛋

白质含量的变化，筛选出与-胡萝卜素积累和蛋

白质含量相关的差异表达蛋白质，为推测出关键

基因和蛋白质，培育优质高营养木薯新品种提供

新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料‘BGM019’、‘SC101’和‘SC9’

由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

第 5 期 周 锴等：木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究 873

儋州国家木薯种质资源圃提供。选择生长健壮、

无病虫感染的木薯主茎为种茎，在直径 40 cm，

高 45 cm 的盆内盆栽种植。盆插木薯杆长 15 cm，

盆栽土为椰糠、菜园土（2 1 ∶ ）的混合基质。常

规管理，并于植后 1 个月进行间苗及补苗，分别

于木薯块根形成期（植后 3 个月）、膨大期（植

后 6 个月）、成熟期（植后 9 个月）取样进行实

验。3 个木薯品种块根成熟期横切面如图 1 所示。

图 1 3 种木薯块根横切面示意图

Fig. 1 Cross sections of tuberous roots of three cassava varieties

1.2 方法

1.2.1 块根可溶性蛋白质含量测定 参 考

CARVALHO 等[2]的丙酮沉淀法经改良后应用于

木薯块根蛋白质的提取，根据蛋白沉淀物含量加

入适量的蛋白质溶解液[9.5 mol/L Urea，2 mol/L

Thiourea，4%（W/V）CHAPS，1% DDT，2.5 mmol/L

EDTA，2.5 mmol/L EGTA]，常温下溶解 45 min

后转移至 0.5 mL 离心管内，常温下以 13 000 r/min

离心 2 min。取上清液，再使用 Sigma 公司生产的

Bradford 试剂盒对蛋白质含量进行测定。

1.2.2 块根 β-胡萝卜素含量测定 参考杨龙等[3]

优化后的方法，以丙酮/石油醚为提取液，甲醇/

叔丁基甲醚（70/30, V/V）为流动相的高效液相色

谱法测定不同生长发育时期木薯块根中 β-胡萝卜

素含量。

1.2.3 块根有色体蛋白质提取、分离、差异蛋白

质分析及质谱鉴定等 参考邓昌哲等[4]改良后的

Percoll 密度梯度离心法提取块根有色体。参考

CHEN 等[5]的苯酚抽提法提取有色体蛋白质，溶

解后离心取上清液后用 Bradford 试剂盒进行定量，

之后再参考 CHEN 等[5]的蛋白质双向电泳技术进

行分离。使用 Delta 2D 软件分析获得的蛋白质双

向电泳图谱，比较分析不同生长发育时期图谱的蛋

白质点，从中选出重复性较好的差异表达蛋白质

点，进行下一步的蛋白质鉴定。参考 AN 等[6]的蛋

白质谱鉴定方法，将样品点到 Anchorchip 标靶上，

并置于质谱仪（Bruker Daltonics）中扫描，进行

肽指纹图谱及二级质谱测定，获取差异蛋白质点

的 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 图谱。使用在线程序

Matrix Science（http://www.matrixscience.com）在

NCBI 数据库（分类学选择绿色植物 Vuiridi plantae）中进行检索，以半胱氨酸碘乙酰胺化为固定

修饰，甲硫氨酸氧化为可变修饰，每次匹配允许最

大的未被酶切位点数为 1，二级质谱肽段质量误差

为 1.5 Da，检出与二级质谱图最佳匹配的多肽段。

1.3 数据处理

采用 Excel 2010 软件和 DPS 7.0 统计软件对

数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 木薯块根不同生育期可溶性蛋白质含量

与-胡萝卜素含量变化分析

从表 1 可看出，‘SC9’、‘BGM019’和‘SC101’

在块根形成期-胡萝卜素含量差异达显著水平

（P<0.05），其中‘SC9’的-胡萝卜素含量最高，

为 1.727 g/g，高于‘BGM019’的 1.063 g/g；

‘SC101’的-胡萝卜素含量最低，为 0.653 g/g。

而‘SC9’（1.270 mg/g）和‘BGM019’（1.150 mg/g）

块根形成期蛋白质含量没有显著性差异，但明显

高于‘SC101’（1.093 mg/g）（P<0.05）。在木薯

块根膨大期，‘SC9’、‘BGM019’和‘SC101’

-胡萝卜素和蛋白质含量与形成期相比，均有明

显提高。‘SC9’-胡萝卜素和蛋白质含量均达最

高，分别为 2.470 g/g 和 1.420 mg/g，‘BGM019’

次之，分别为 1.210 g/g 和 1.280 mg/g，‘SC101’

最低，分别为 0.807 g/g 和 1.143 mg/g。在木薯

874 热带作物学报 第 43 卷

块根成熟期，‘SC9’和‘BGM019’的-胡萝卜

素（‘SC9’：2.737 g/g；‘BGM019’：1.267 g/g）

和蛋白质含量（‘SC9’：1.537 mg/g；‘BGM019’：

1.383 mg/g）均比膨大期高，相反‘SC101’块根

-胡萝卜素（‘SC101’：0.653 g/g）和蛋白质含

量（SC101：0.883 mg/g）比膨大期低。

表 1 块根形成期、膨大期和成熟期 β-胡萝卜素

与蛋白质含量分析

Tab. 1 Analysis of β-carotenoid and protein contents

during formation, enlargement and maturation periods

of tuberous roots

木薯块根不同发育期

Developmental stages

of cassava tuberous

roots

木薯品种

Cassava

varieties

β-胡萝卜素含量

β-carotenoid

contents

/(μg·g–1)

蛋白质含量

Protein contents

/(mg·g–1)

SC9 1.727±0.035a

1.270±0.044a

BGM019 1.063±0.012b

1.150±0.021ab

形成期

SC101 0.653±0.030c

1.093±0.035b

SC9 2.470±0.046a

1.420±0.040a

BGM019 1.210±0.027b

1.280±0.029ab

膨大期

SC101 0.807±0.026c

1.143±0.029b

SC9 2.737±0.068a

1.537±0.060a

BGM019 1.267±0.030b

1.383±0.029a

成熟期

SC101 0.653±0.025c

0.883±0.045b

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

从表 1 可知，随着‘SC9’块根发育从形成

期到膨大期到成熟期，β-胡萝卜素与蛋白质含量

也逐渐升高，成熟期达到最高。在不同的发育期，

随着 β-胡萝卜素含量的积累，蛋白质含量也呈上

升趋势。‘BGM019’的 β-胡萝卜素和蛋白质含量

均是随着块根的不断成熟而积累增多；但

‘SC101’块根中 β-胡萝卜素和蛋白质含量却是

在块根膨大期时达到最大值，到成熟期反而下降。

根据这一结果对不同木薯品种在块根发育的不同

阶段进行收获以获得最大的食用营养品质。

2.2 木薯块根不同生育期有色体蛋白质组学

分析

2.2.1 ‘SC9’块根不同生育期有色体蛋白质组

学分析 ‘SC9’块根成熟期与膨大期有色体蛋

白质表达图谱如图 2 所示。‘SC9’块根成熟期有

色体与膨大期有色体蛋白质组相比，有 36 个差异

表达的蛋白质点，其中上调表达 26 个，下调表达

10 个。经 MALDI- TOF-TOF-MS/MS 质谱法结合

在线程序 MASCOT 与 NCBI 数据库搜索分析，成

功鉴定到其中 23 个差异蛋白质，包括上调表达蛋

白质 15 个，下调表达蛋白质 8 个，其详细信息见

附表 1。这些差异蛋白质涉及能量代谢（3 个）、

分子伴侣（5 个）、抗氧化（5 个）、细胞骨架（3

个）、核酸代谢（1 个）、防御（1 个）、无机离子

运输及代谢（1 个）共 7 个蛋白质功能群，此外，

还包括 4 个功能未知的蛋白质。参与碳代谢与能

量代谢的蛋白有 ATP 结合蛋白及磷酸丙糖异构

酶；抗坏血酸类过氧化酶、超氧化物歧化酶及硫

氧还蛋白与抗氧化相关；分子伴侣主要为各种热

激蛋白；酰谷胱甘肽裂解酶参与细胞防御；与结

构相关的主要为肌动蛋白及等离子体膜多肽家

族蛋白；而与无机离子运输及代谢相关蛋白主要

为钙调蛋白。

A：成熟期；B：膨大期（对照）；C：2 个生育期差异表达情况；黑色箭头指示上调表达，白色箭头指示下调表达。

A: Maturation period; B: Enlargement period; C: Differential proteins distribution in maturation period and enlargement period;

The tuberous-root chromoplast of the enlargement period was used as a reference. The black arrows indicate up-regulation,

and the white arrows indicate down-regulation.

图 2 ‘SC9’块根不同生育期有色体蛋白质组学分析

Fig. 2 Chromosome proteomic analysis of ‘SC9’ tuberous root tuber at different developmental stages

第 5 期 周 锴等：木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究 875

2.2.2 ‘BGM019’块根不同生育期有色体蛋白

质组学分析 ‘BGM019’成熟期与膨大期块根

有色体蛋白质的表达图谱如图 3 所示。‘BGM019’

块根成熟期有色体与膨大期有色体蛋白质组相

比，共得到 49 个差异表达量在 2.0 倍以上的蛋白

质点，其中 28 个上调表达，21 个下调表达。经

二级质谱鉴定技术结合数据库搜索分析，成功鉴

定到其中 37 个差异蛋白质，其中包括上调点 20

个，下调点 17 个，其详细信息见附表 2。这些差

异蛋白质涉及能量代谢（7 个）、分子伴侣（7 个）、

抗氧化（7 个）、结构（5 个）、核酸代谢（2 个）、

蛋白合成（1 个）、光合作用相关（1 个）、信号转

导（1 个）、无机离子运输及代谢（1 个）共 9 个

蛋白质功能群，此外，还包括 5 个功能未知的蛋

白质。参与碳代谢和能量代谢的 7 个蛋白质中，

分别为异黄酮还原酶、磷酸丙糖异构酶、ADP 葡

糖焦磷酸化酶、ATP 合酶 β 亚基、芥子醇脱氢酶、

尿卟啉原脱羧酶、多萜基磷酸甘露糖合成酶；7

个分子伴侣主要为各种热激蛋白；抗坏血酸类过

氧化酶为主要的抗氧化蛋白质；与蛋白合成相关

的是一个延伸因子；与核酸代谢相关的蛋白质为

富含甘氨酸的 RNA 结合蛋白和二磷酸核苷激酶

B；参与信号转导的为表达上调的生长素应答蛋

白 X10A；钙调蛋白参与无机离子运输及代谢过

程，上调表达。

2.2.3 ‘SC101’块根不同生育期有色体蛋白质

组学分析 以膨大期块根有色体蛋白质图谱为对

照，对膨大期及成熟期块根有色体的双向电泳图

谱进行分析，如图 4A~C 所示。共发现 38 个重复

性较好且差异表达量达 2.0 倍以上的蛋白质点，

其中上调蛋白质点为 20 个，其余 18 个为下调蛋

白。经过 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 鉴定技术成功

鉴定出其中的 31 个蛋白质，包括 15 个上调表达

蛋白质和 16 个下调表达蛋白质。

A：成熟期；B：膨大期（对照）；C：2 个生育期差异表达情况；黑色箭头指示上调表达，白色箭头指示下调表达。

A: Maturation period; B: Enlargement period; C: Differential proteins distribution in maturation period and enlargement period;

The tuberous-root chromoplast of the enlargement period was used as a reference. The black arrows indicate up-regulation,

and the white arrows indicate down-regulation.

图 3 ‘BGM019’块根不同生育期有色体蛋白质组学分析

Fig. 3 Chromosome proteomic analysis of ‘BGM019’ tuberous root tuber at different developmental stages

A：成熟期；B：膨大期（对照）；C：2 个生育期差异表达情况；黑色箭头指示上调表达，白色箭头指示下调表达。

A: Maturation period; B: Enlargement period; C: Differential proteins distribution in maturation period and enlargement period;

The tuberous-root chromoplast of the enlargement period was used as a reference. The black arrows indicate up-regulation,

and the white arrows indicate down-regulation.

图 4 ‘SC101’块根不同生育期有色体蛋白质组学分析

Fig. 4 Chromosome proteomic analysis of ‘SC101’ tuberous root tuber at different developmental stages

876 热带作物学报 第 43 卷

这些差异蛋白质涉及能量代谢（8 个）、分子

伴侣（5 个）、抗氧化（3 个）、结构（3 个）、蛋

白合成（1 个）、氨基酸代谢（1 个）、光合作用相

关（1 个）、信号转导（1 个）、无机离子运输及代

谢（1 个）共 9 个蛋白质功能群，此外，还包括 7

个功能未知的蛋白质（附表 3）。8 个参与碳代谢

和能量代谢的蛋白质中，包括表达上调的 ATP 结

合蛋白，下调表达的磷酸甘油酸酯酶、葡萄糖基

转移酶、丙酮酸脱氢酶 E1β 亚基等；除硫氧还蛋

白 H 表达下调外，抗坏血酸过氧化酶及异黄酮还

原酶等与抗氧化相关的蛋白质上调表达；天冬氨

酸蛋白酶前体参与氨基酸代谢；与生长素相关的

SAUR 家族蛋白上调表达；同样上调表达的还有

参与无机离子运输与代谢的钙调蛋白。

2.3 3 个木薯品种不同生育期块根有色体差异

表达蛋白质分析

木薯生长发育进入成熟期后，‘SC9’块根有

色体检测出 36 个差异表达蛋白质，‘BGM019’

块根有色体中检测到 49 个蛋白质出现了差异表

达，而‘SC101’块根有色体则检测到 38 个差异

表达蛋白质。利用质谱法结合数据库搜索成功鉴

定出 23 个在‘SC9’块根有色体内差异表达的蛋

白质点、37 个在‘BGM019’块根有色体内差异

表达的蛋白质点，以及 31 个在‘SC101’块根有

色体内差异表达的蛋白质点。对比分析 3 个品种

木薯块根有色体差异蛋白质（图 5），发现 5 个差

异表达蛋白质在 3 个品种内表达趋势相同，其中

2 个蛋白质均上调表达，2 个蛋白质均下调表达。

但有 1 个蛋白质表达特殊，仅在‘SC9’块根有

色体中下调表达，而在另外 2 个品种内上调表达。

此外，‘SC9’与‘BGM019’块根有色体共同出

现了 4 个差异表达蛋白质，除了 1 个蛋白质在

‘SC9’上调表达，而在‘BGM019’则下调表达

外，其他 3 个均表现为相同表达特性。而‘SC9’

与‘SC101’块根有色体蛋白质有 2 个共同的蛋

白质出现差异表达，且均为上调表达。‘BGM019’

与‘SC101’块根有色体中则发现了 9 个共同表

达的蛋白质，其中有 1 个功能未知的蛋白质在

‘BGM019’内下调表达而在‘SC101’中则上调

表达，另外 8 个共同差异表达的蛋白质中，6 个

均为下调表达，2 个均为上调表达。

对 3 种品种块根有色体间共有差异表达的蛋

白质点进行功能分析，发现它们主要涉及碳代谢

与能量代谢、分子伴侣、抗氧化、细胞骨架蛋白、

蛋白质合成、无机离子运输与代谢和光合作用等。

其中抗氧化、分子伴侣和细胞骨架蛋白各占 20%，

碳代谢与能量代谢占 10%，而蛋白质合成、无机

离子运输与代谢以及光合作用各占 5%，功能未知

的占 15%（附表 4）。

2.4 木薯块根有色体类胡萝卜素合成蛋白质

生物调控网络

通过‘SC9’、‘BGM019’和‘SC101’块根

有色体差异蛋白质鉴定得出，‘SC9’有色体的独

有蛋白质 12 个，‘BGM019’有色体 19 个，‘SC101’

15 个（表 2）。这些有色体特有的差异蛋白质对黄

心木薯和白心木薯在类胡萝卜素和蛋白质的积累

中起到比较重要的作用，根据 KEGG 代谢途径的

数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）

图 5 3 个木薯品种间有色体差异蛋白质点关系

Fig. 5 Relationship of differential protein spot in chromoplasts of three cassava varieties

第 5 期 周 锴等：木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究 877

表 2 3 种木薯块根有色体特有的差异蛋白质

Tab. 2 Unique differential proteins in chromoplasts of tuberous roots in three cassava varieties

木薯品种

Cassava varieties

蛋白质功能

Protein functional classification

蛋白质点编号

Spot number

鉴定

Identification

碳代谢与能量代谢相关蛋白 8 protein yrdA, putative - R. communis (+)

2 chaperonin 60 beta - wheat (fragment) (+)

17 heat-shock protein, putative- R. communis (-)

分子伴侣

21 HSP19 class II - Citrus × paradise (-)

抗氧化 11 superoxide dismutase [Mn], mitochondrial (-)

22 copper/zinc superoxide dismutase - M. esculenta (-)

结构 9 DREPP plasma membrane polypeptide family protein - P. trichocarpa (+)

DNA 和 RNA 代谢相关蛋白 23 nucleoside diphosphate kinase B (+)

防御 5 lactoylglutathione lyase, putative - R. communis (+)

1 hypothetical protein RCOM_0537780 - R. communis (+)

4 hypothetical protein RCOM_1272620 - R. communis (+)

SC9(12)

功能未知蛋白

20 predicted protein - P. trichocarpa (-)

26 ADPglucose pyrophosphorylase - Oryza sativa (-)

27 ATP synthase subunit beta, mitochondrl; Flags: Precursor (-)

33 sinapyl alcohol dehydrogenase - P. tremuloides (-)

34 uroporphyrinogen decarboxylase, putative - R. communis (-)

36 isoflavone reductase, putative - R. communis (+)

碳代谢与能量代谢相关蛋白

39 dolichyl-phosphate mannose synthase- Rothia dentocariosa ATCC 17931 (-)

24 molecular chaperone Hsp90-1 - N. benthamiana (+)

41 Ran GTPase binding protein, putative - R. communis (-)

分子伴侣

44 heat shock protein, putative - R. communis (+)

25 monodehydroascorbate reductase family protein - P. trichocarpa (+)

35 ferritin, plant, putative - R. communis (+)

抗氧化

38 ascorbate peroxidase APX2 - M. esculenta (+)

结构 47 charged multivesicular body protein 2a, putative - R. communis (+)

DNA 和 RNA 代谢相关蛋白 48 glycine-rich RNA-binding protein - Citrus unshiu (+)

51 nucleoside diphosphate kinase B (+)

信号转导 46 auxin-induced protein X10A, putative- R. communis (+)

37 conserved hypothetical protein - R. communis (+)

40 conserved hypothetical protein - R. communis (-)

BGM(19)

功能未知蛋白

49 conserved hypothetical protein - R. communis (+)

53 phosphoglycerate kinase, putative - R. communis (-)

54 dihydrolipoyllysine-residuesuccinyltransferase component of

2-oxoglutarate dehydrogenase complex - Z. mays (-)

56 UDP-glucosyltransferase, putative - R. communis (-)

57 pyruvate dehydrogenase E1 beta subunit isoform 1- Zea mays (-)

58 NADP-dependent malic enzyme - Camellia sinensis (-)

64 fasciclin-like arabinogalactan protein 8 - A. thaliana (+)

碳代谢与能量代谢相关蛋白

66 N-acetyltransferase, putative - R. communis (+)

分子伴侣 63 heat-shock protein, putative - R. communis (-)

氨基酸代谢 59 aspartic proteinase precursor, putative- R. communis (-)

信号转导 65 SAUR family protein - T. cacao (+)

无机离子运输及代谢 62 calmodulin, putative- R. communis (+)

52 unknown - P. trichocarpa (-)

55 conserved hypothetical protein - R. communis (+)

60 predicted protein - P. trichocarpa (-)

SC101(15)

功能未知蛋白

61 hypothetical protein POPTR_0017s02700g - P. trichocarpa (+)

注：（+）和（–）分别表示差异蛋白质表达水平上调和下调。

Note: (+) and (–) indicate up-regulated and down-regulated on differential protein expression, respectively.

878 热带作物学报 第 43 卷

和差异蛋白质的功能构建木薯块根有色体类胡萝

卜素合成蛋白质生物调控网络，如图 6 所示。

类胡萝卜素的合成和积累涉及糖酵解、三羧酸

循环和 MEP/DOXP 等代谢途径，其中 MEP/DOXP

主要发生在有色体中。在‘SC9’、‘BGM019’和

‘SC101’块根有色体的独特蛋白质主要和糖酵

解、三羧酸循环和 MEP/DOXP 等代谢途径相关。

据报道，在花椰菜中发现的 OR 蛋白具有类似

DnaJ 的锌指结构，能够调控细胞中丰富的前体或

无色体向有色体转变，在有色体中形成丰富的类

胡萝卜素螯合结构，从而使大量的 β-胡萝卜素积

累得到合成和积累[7]。研究还发现独特的类胡萝

卜素生物合成调控因子能促进有色体的发育，如

在番茄中发现的 HSP21 能够促进叶绿体向有色体

的转化，过量表达 HSP21 促进了果实提前积累类

胡萝卜素[8]。在本研究中黄心木薯‘SC9’和

‘BGM019’的 chaperones 蛋白质均有上调表达，

而‘SC101’的 chaperones 蛋白质下调，这也说

明黄心木薯有色体形成比白心木薯多，黄心木薯

类胡萝卜素合成和积累比白心木薯高（表 2）。

图 6 木薯块根有色体类胡萝卜素合成蛋白质生物调控网络

Fig. 6 Biological regulation network of carotenoids synthesis in chromoplasts of cassava tuberous roots

3 讨论

本研究结果表明，随着黄心木薯‘SC9’和

‘BGM019’块根发育成熟，从形成期、膨大期

至成熟期，其块根蛋白质含量和类胡萝卜素含量

呈不断增加趋势，且二者成正相关。原因主要是

木薯块根中有色体是类胡萝卜素的载体，而有色

体一般认为是由白色体或叶绿体转变而形成的。

在木薯块根中白色体主要是淀粉体，因此，淀粉

体向有色体转变后，为类胡萝卜的合成和积累提

供了场所和载体。为保证有色体结构稳定和功能

发挥以及类胡萝卜素积累的持续，导致一系列蛋

白质参与促成这些代谢过程的稳定运行，因而从

总体上提高了蛋白质的含量。本研究结果与

CARVALHO 等[8]研究结果一致。

以‘SC9’与‘SC101’为例，其类胡萝卜素

含量在 2 个生长发育时期差异均达极显著，而

‘SC9’上调表达蛋白质在差异表达蛋白质中占

优势，这可能与其有色体类胡萝卜积累能力更强

相关。此外，对 3 个木薯品种在膨大期与成熟期

差异蛋白质点进行进一步的对比分析发现，20 个

差异表达蛋白质在其中 2 个品种或 3 个品种间出

现相同的表达趋势。但这 20 个差异蛋白质点表达

特征并不完全一致，有 4 个差异蛋白质点在其中

1 个品种上调表达，而在另外的 1 个或 2 个品种

则下调表达。这 4 个差异蛋白质点分别是：属于

细胞骨架蛋白的肌动蛋白（actin-1），其在‘SC9’

块根有色体上调表达，而在‘BGM019’块根有

色体则下调表达；功能未知的假定蛋白

第 5 期 周 锴等：木薯块根不同发育期 β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究 879

（ hypothetical protein SORBIDRAFT_08g0185

60），在‘BGM019’块根有色体下调表达，而在

‘SC101’块根有色体则上调表达；分子伴侣的

小热激蛋白（small heat shock protein isoform 2-T.

cacao），其在‘SC9’块根有色体下调表达，而在

‘BGM019’及‘SC101’块根有色体均上调表达；

以及在‘SC9’表达上调，而在‘BGM019’表达

下调的抗坏血酸过氧化物酶。肌动蛋白是生物体

中微丝的两个单体亚基之一，对细胞活动起着很

大的作用，比如细胞的转移、分裂和原质的流动、

细胞间信息的传递、以及细胞的形状和连结的建

立和维持等[9]。因此推测‘SC9’块根成熟期由于

类胡萝卜素的不断积累导致细胞活动更频繁，从

而使肌动蛋白上调表达。抗坏血酸过氧化物酶

（APX）是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之

一，在植物抗氧化系统中，是清除过氧化氢的主

要酶类。有关拟南芥的某些研究表明，APX2 主

要在极端光照或者热胁迫时起作用。有研究表明

APX2 也与信号转导相关，而且 ABA 也参与到了

此信号转导的调控网络中[10]。APX2 在‘SC9’上

调表达，在‘BGM019’下调表达，而成熟期时

‘SC9’类胡萝卜含量极显著高于‘BGM019’，

可能是由于 APX2 提高了信号转导的效率，同时

ABA 促进了类胡萝卜素的积累；当细胞受到感

染、热激或氧化损伤等反应时，热激蛋白会大量

表达，识别错误折叠或去折叠的蛋白质，同时标

记它们以供蛋白酶体降解[11]。而小热激蛋白在

‘SC9’下调表达，而在‘BGM019’和‘SC101’

均上调表达，推测在成熟期时 3 个品种同时发生

了细胞应激反应，从而导致热激蛋白的表达，而

其在‘BGM019’和‘SC101’中上调表达，则致

使一些蛋白质被降解，从而导致块根蛋白质含量

下降。

还有 16 个差异表达蛋白质点在 3 个品种间或

两两间表达特征一致，主要功能为抗氧化（3 个，

占总相同差异蛋白质点的 15%）、碳代谢与能量代

谢（2 个）、分子伴侣（3 个）、细胞骨架蛋白（3

个）、蛋白合成（1 个）、光合作用（1 个）和无机

离子运输与代谢（1 个），另外 2 个蛋白质功能未

知。抗氧化类的主要为 L-抗坏血酸氧化酶、硫氧

还蛋白 h、异黄酮还原酶同系物。碳代谢与能量

代谢的主要为磷酸丙酮异构酶、ATP 结合蛋白。

分子伴侣类均为热激蛋白，而细胞骨架蛋白主要

为肌动族蛋白，以及 Remorin 蛋白。与无机离子

运输与代谢相关的蛋白是钙调蛋白，而与光合作

用相关的蛋白质与光系统Ⅰ相关。

抗坏血酸氧化酶是一种存在于细胞质中，能

与细胞壁结合的含铜的酶，作为一种末端氧化酶

参与一系列的氧化还原反应。能催化抗坏血酸的

氧化过程，具有抗衰老等作用，是植物体内物质

代谢中重要的酶类。有研究表明，使用脱落酸

（ABA）处理植物后，植株体内抗坏血酸氧化酶

的活性显著提高，而 ABA 是类胡萝卜素合成的前

体[12]，因此抗坏血酸氧化酶活性也影响类胡萝卜

素的合成与积累。硫氧还蛋白 h 主要存在植物细

胞质内，内质网和线粒体内也有发现。硫氧还蛋

白在谷物类种子中含量丰富，在种子萌发初期作为

种子萌发的信号，导致水解酶抑制剂失活，从而激

活丝氨酸蛋白酶活性，最终导致蛋白质降解[13]。

还可参与细胞通讯、繁殖等过程。硫氧还蛋白 h

活性在 3 个品种木薯块根成熟期都表达上调，而

3 个品种木薯块根成熟期蛋白质含量高于膨大期

含量，故推测硫氧还蛋白 h 促进了合成酶活性，

使蛋白质含量升高。

磷酸丙糖异构酶在糖酵解中的作用不可替

代，是有效的能量生成不可或缺的酶。ATP 结合

蛋白也与能量代谢相关，而‘SC9’在成熟期这 2

个蛋白均上调表达，而‘BGM019’和‘SC101’

分别是磷酸丙糖异构酶与 ATP 结合蛋白上调表

达，说明类胡萝卜素的积累与蛋白质的合成都是

需要大量能量的代谢过程，而 3 个木薯品种在能

量代谢的主要途径上有相同也有不同的地方。

Remorin 蛋白是一个与质膜/脂筏相联的植物

专一性的蛋白家族，在细胞骨架和膜骨架中发挥

重要作用，而且可能参与植物发育过程中的信号

转导，响应植物防御及生长发育基因的激活而磷

酸化[14]。因此，在块根成熟期，在 3 个木薯品种

块根表达水平均上调，提高了信号转导的效率，

促进了块根的生长发育，提高了类胡萝卜素及蛋

白质的积累。

钙调蛋白（也称钙调素）是一种能与钙离子

相结合的蛋白，且仅在与 Ca2+结合后才具有活性。

但其可以与多种蛋白质相结合，从而影响细胞功

能的发挥。主要可参与新陈代谢、细胞内运动、

细胞凋亡等生命活动。但很多钙调素结合蛋白本

身并不能与钙离子直接结合，但钙离子在细胞信

号传导过程中作为第二信使，意义重大，因此这

些钙调素结合蛋白便利用钙调素作为钙感应器和

880 热带作物学报 第 43 卷

信号转导分子[15]。转录以及如磷酸化、乙酰化和

蛋白酶解等的翻译后修饰均可调节钙调蛋白的功

能[16]。钙调蛋白表达水平的上调提高了块根有色

体在类胡萝卜素积累及蛋白质合成过程中信号转

导的效率，使块根迅速响应类胡萝卜素及蛋白质

的合成与积累机制，提高蛋白质含量与类胡萝卜

素的积累。

很多与信号转导相关的蛋白质表达上调，促

进了整个过程的信号转导效率，加速块根对蛋白

质含量与有色体类胡萝卜素积累偶联机制的响

应，从而提高了蛋白质含量与类胡萝卜素含量。

整个积累代谢过程是需要大量能量供应的，从而

导致了与能量代谢相关的蛋白质表达上调。因此，

根据上述代谢过程中相关蛋白表达水平的变化，

说明影响木薯块根蛋白质含量与有色体中类胡萝

卜素的积累的蛋白质表达是一个复杂的调控过

程，是由很多蛋白质群组协同作用的结果。

4 结论

随着木薯块根发育成熟，-胡萝卜素含量和

蛋白质含量均呈上升趋势，且二者之间表现为正

相关。说明食用木薯块根中蛋白质含量与 β-胡萝

卜素的积累可能存在一定的关联性。3 个食用木

薯品种在同一生长发育时期 β-胡萝卜素含量差异

达极显著水平，‘BGM019’和‘SC9’蛋白质含

量差异不显著，但显著高于‘SC101’。

以膨大期木薯块根为对照，研究成熟期木薯

块根有色体蛋白质表达的变化，在‘SC9’成熟

期块根有色体检测到 36 个差异表达蛋白质点，其

中 26 个上调表达，10 个下调表达；在‘BGM019’

成熟期块根有色体检测到 49 个差异表达量达 2.0

倍以上的蛋白质点，其中 28 个上调表达，21 个

蛋白质下调表达；而在‘SC101’成熟期块根有

色体则检测到 38 个差异表达的蛋白质点，其中有

20 个上调表达，18 个下调表达。上述差异表达蛋

白质分别参与碳代谢与能量代谢、抗氧化、蛋白

质合成、无机离子运输与代谢等多个代谢途径，

说明木薯块根蛋白质含量的提高和类胡萝卜素积

累是由多个代谢途径协同作用的结果。

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热带作物学报 2022, 43(5): 882892

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2021-10-27；修回日期 2021-12-31

基金项目 海南省自然科学基金项目（No. 321MS077）；广东省重点研发计划项目（No. 2018B020202011）；国家荔枝龙眼

产业技术体系项目（No. CARS-32-20）。

作者简介 董 晨（1981—），女，硕士，副研究员，研究方向：热带果树生理生化及分子生物学。*通信作者（Corresponding

author）：李伟才（LI Weicai），E-mail：lwc-619@163.com。

基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析

董 晨，李金枝，郑雪文，王 弋，李伟才*

中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/农业农村部热带果树生物学重点实验室，广东湛江 524091

摘 要：泛素结合酶在泛素化级联反应中居于中心位置，是连接泛素活化酶和泛素连接酶的桥梁，在泛素化系统中发

挥着关键作用。本研究基于荔枝转录组数据库，利用生物信息学方法对转录组数据库泛素结合酶 UBC 基因家族进行鉴

定，最终得到 28 个 LcUBC 基因家族成员。通过荧光定量 PCR 技术对 LcUBC 基因家族在‘妃子笑’荔枝不同组织中

进行时空表达分析，并对花穗对照和烯效唑处理花穗发育的不同时期进行表达分析。结果表明：LcUBC 基因家族成员

对应所编码的氨基酸数分布在 85~1146 aa 之间，等电点大小在 4.03~9.61 之间，5 个 LcUBC 蛋白为稳定蛋白，其余均

为不稳定蛋白。2 个 LcUBC 蛋白定位于细胞质，2 个 LcUBC 蛋白定位于细胞质和细胞核，1 个 LcUBC 蛋白定位于内

质网，其余蛋白均定位于细胞核。系统进化分析结果表明，LcUBC 蛋白分为 10 个亚家族；28 个 LcUBC 基因家族成员

在不同组织的表达量存在差异；烯效唑处理‘妃子笑’荔枝花穗与对照相比，烯效唑处理 21 d 后，LcUBC 基因家族成

员的多个基因表达量较高。这是在转录组水平分析 LcUBC 基因家族成员，本研究结果对今后该基因家族的分类、克隆

和功能研究提供了参考依据。

关键词：荔枝；泛素结合酶；基因家族；表达分析

中图分类号：S667.1 文献标识码：A

Transcriptome-wide Identification and Analysis of UBC Gene Family

in Litchi chinensis Sonn.

DONG Chen, LI Jinzhi, ZHENG Xuewen, WANG Yi, LI Weicai*

Institute of South Subtropical Corp Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science / Key Laboratory of Tropical Fruit

Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhanjiang, Guangdong 524091, China

Abstract: Ubiquitin-conjugating enzymes play a central role in the ubiquitination cascade. They are the bridge between

ubiquitin activating enzymes and ubiquitin ligases, and play a key role in the ubiquitination system. Through the local

BLAST search and keyword search of transcriptome database, 32 ubiquitin-conjugating enzyme gene family members,

including 5 UEV and 28 UBC genes, were obtained through smart screening of conserved domains. Only LcUBC1–

LcUBC28 was studied in the article. Based on the litchi transcriptome database, the ubiquitin-conjugating enzyme gene

family was identified by bioinformatics methods, and the temporal and spatial expression of ubiquitin-conjugating enzyme gene family in different tissues and organs of Feizixiao litchi was analyzed by the fluorescence quantitative PCR

technology. Meanwhile, the expression of the control and uniconazole treatment at different stages of flower development was analyzed. The results showed that the amino acids were 85–1146 aa. The isoelectric point ranged from 4.03 to

9.61. Five LcUBC proteins were stable, and the others LcUBC proteins were unstable. Two LcUBC proteins were located in cytoplasm, two LcUBC proteins in cytoplasm and nucleus, one LcUBC protein in endoplasmic reticulum and

the rest LcUBC proteins in nucleus. There were great differences in the length of the protein and the changes in the

characteristics of the protein, indicating that the proteins of the ubiquitin protease gene family had different characteristics. In the multiple sequence alignment, all 28 LcUBC genes contained an evolutionarily highly conserved amino acid

第 5 期 董 晨等：基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 883

residue cysteine active site, and the C-terminal tryptophan (W) located behind the cysteine active site. The 28 LcUBC

proteins were also highly conserved, and the “HPNI” conserved motif was located 7–10 amino acids before the active

site of cysteine. The LcUBC gene family was predicted to contain 10 conserved motifs. There were certain differences

in the number and types of conserved motifs contained in the members of the LcUBC gene family. Among them, the

conserved motifs 1 and 2 were very important conserved motifs in the LcUBC domain. Phylogenetic analysis showed

that the litchi UBC protein was divided into 10 subfamilies, namely UBC1, UBC2/11, UBC3/7, UBC4/5, UBC6, UBC8,

UBC10/12, UBC13, UBC14, UBC15. The 28 LcUBC genes were expressed in at least one tissue, and the expression

levels of different genes in different tissues were different. Among them, the expression of LcUBC4, LcUBC5, and

LcUBC18 in seeds were significantly higher than that of other tissues, and the expression of LcUBC7 in male flowers

was significantly higher than that of other tissues. The expression level of female flowers of LcUBC14 and LcUBC15

was significantly higher than that of other tissues, and LcUBC10 was highly expressed in pericarp and old leaves.

Compared with the control, the expression levels of LcUBC genes in different developmental stages of Feizixiao litchi

flower spikes treated with uniconazole were higher at 21 days after the treatment with Uniconazole. This is the first time

that the litchi UBC gene family was analyzed at the transcriptome level. The results of the study would provide some

referrences for future studies on the classification, cloning and function of this gene family.

Keywords: Litchi chinensis Sonn.; ubiquitin-conjugating enzyme; genes family; expression analysis

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.002

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是热带、亚热

带发展中国家的最重要的作物之一。目前荔枝产

业已成为中国华南热作产业的支柱产业之一，对

中国南方农村经济的发展和热区农民收入水平的

提高发挥了举足轻重的作用。2018 年是我国有史

以来最丰产的一年，据不完全统计，全国荔枝种

植面积约为 54.2 万 hm2

，产量约为 301 万 t，种

植面积排在苹果、柑橘、梨、葡萄和桃之后，属

于大宗果树，但从总产量来看却还算“小水果”。

2018 年荔枝结果面积按照总种植面积的 80%计

算，平均单产不足 7.0 t/hm2[1]。‘妃子笑’具有

花穗长、花量大、坐果率低的特点，坐果率低是

其生产中亟待解决的一个“瓶颈”问题，调控坐

果的分子机理是当今果实发育领域研究的一个热

点问题。

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome

pathway，UPP）广泛存在于真核生物中，并且在

维持细胞功能、细胞周期运转、抵御环境胁迫、

胚胎发育、激素响应和衰老等方面发挥着重要的

作用[2-5]。在泛素化过程中，关键酶主要包括泛素

活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素-蛋白

连接酶（E3）。编码 E2 及 E2-like 的基因已报道

37 个，根据结构和序列的相似性可分为 12 个亚

家族或 14 个组，E2-like 基因 8 个[6]。E2 蛋白的

典型特征是包含一个长约 140~200 aa 的保守催化

结构域——UBC 结构域，内含有 1 个高度保守的

半胱氨酸活性位点，另外还存在一类 UEV

（ubiqutin E2 variants）蛋白，该蛋白家族在序列

和结构上与泛素结合酶相似，但是缺少半胱氨酸

催化位点，其功能也与典型的泛素结合酶蛋白有

所不同。E2 多以基因家族的形式存在，参与许多

植物生理活动[7]。泛素结合酶在泛素化级联反应

中居于中心位置，是连接泛素活化酶和泛素连接

酶的桥梁，在泛素化系统中发挥关键的作用。

目前，对 E2 基因的研究多集中在对 DNA 的

修复进程。如在核酸修复途径中，UBC35/UBC36

和 Mms2p/Uev1a 蛋白形成复合物，在赖氨酸位

点催化形成泛素链，来引发核酸修复的信号转导，

完成对受损核酸的修复[8]。UBC13 协同 E3 连接

酶 RNF 8 相互作用形成复合物，DNA 损伤信号通

过依赖泛素化的信号途径来传递至染色质，引发

染色质蛋白的磷酸化，促使 RNF 8-UBC 13 复合

物定位到受损伤的核酸部位，产生泛素链后触发

DNA 修复信号通路，使 RAP 80 蛋白和整个

Brca1A 复合物定位到受损伤的 DNA 部位，对损

伤的 DNA 进行修复[9]。另外还有研究表明 RNF

8-UBC 13 复合物可独立的行使底物蛋白的泛素

化，并促进 DNA 损伤的调节子 53BP1 蛋白的积

累[10]。

泛素结合酶在植物衰老和果实发育过程中起

重要作用。PICTON 等[11]首次从番茄中克隆到泛

素结合酶基因，研究发现泛素结合酶基因在番茄

叶片衰老和果实成熟过程中表达。香蕉采后早期

抑制差减文库中筛选得到香蕉中的泛素结合酶基

因 MaUCEI，该基因介导细胞内小的调节蛋白的

降解，与酵母中的 UBC 4/UBC 5 结合，推测该基

884 热带作物学报 第 43 卷

因可能通过影响果实成熟过程中淀粉酶的活性或

含量而参与对淀粉降解的调控，在果实成熟衰老

的分解代谢中发挥作用[2]。2013 年日本学者研究

表明，大豆近等基因系成熟基因座等位基因 E2/E3

对基因型的修饰可以提供新品种，与对照相比，

新品种花期较晚且产量高，可以适应不同的纬度

环境，并可保留原来的种子质量[12]。WANG 等[13]

研究发现，番茄中 2 个 E2 基因（SlUBC 32 和

SlUBC 41）参与调控番茄果实成熟，但具体分子

调控机制尚不清楚。DONG 等[14]研究香蕉花后果

实不同发育阶段 E2 基因家族的表达情况，结果发

现 E2 基因家族不同成员在果实发育不同阶段行

使功能，推测这些基因在果实发育过程中发挥关

键作用。陈曙等[15]研究低磷处理下玉米幼苗不同

组织中 E2 基因的表达情况，结果发现 ZmUBC 17

基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，

推测 ZmUBC 17 基因是通过调控玉米对磷元素吸

收和转运间接影响光合作用效率。

通过对拟南芥基因组数据库搜索显示，E2 基

因以多拷贝形式存在，造成 E2 蛋白功能冗余，这

可能是使 E2 基因的研究进展不大的主要原因[7]。

近年来，随着基因组测序技术的不断提高，越来

越多的植物完成全基因组的测序工作，越来越多的

植物物种中泛素结合酶基因家族在基因组学上得

到鉴定，如玉米[16]、可可[17]、水稻[18]、葡萄[19]、

普通油茶[20]和香蕉[14]等。目前，关于荔枝基因家

族的研究有 XTH[21]、ARF[22-23]基因家族，关于荔枝

泛素结合酶基因家族仅仅研究了LcUBC12 基因[24]。

本研究基于荔枝转录组数据库，利用生物信

息学方法对转录组数据库 UBC 基因家族进行鉴

定，并通过荧光定量 PCR（qPCR）技术对 LcUBC

基因家族在‘妃子笑’荔枝不同组织中进行时空

表达分析，并对花穗对照和烯效唑处理花穗发育

的不同时期进行表达分析，挖掘关键的 LcUBC 基

因家族成员，为今后 LcUBC 基因功能的研究奠定

基础。本研究结果将为从蛋白质降解方面深化荔

枝坐果机理的研究和生产上调控荔枝坐果技术措

施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为‘妃子笑’荔枝，取自广东省湛

江市麻章区湖光镇湖秀路一号南亚热带作物研究

所荔枝栽培示范园，荔枝 UBC 蛋白序列来源于本

课题组前期构建的‘妃子笑’花穗发育转录组数

据库（GenBank accession SRP092890）。

1.2 方法

1.2.1 LcUBC 基因家族的鉴定与分析 利用模

式植物拟南芥和水稻 UBC 序列作为探针序列，运

用本地 Blast 软件对荔枝测序转录组数据库中的

unigene 进行搜索；同时，利用关键词“Ubiquitinconjugating enzymes”和“UBC”直接检索，得到

所有可能的 UBC 序列后，对检索结果进行整合分

析，去除重复序列后，利用 Pfam 在线软件对序列

保守结构域进行鉴定，去除不含 LcUBC 基因家族

保守结构域的序列。

1.2.2 LcUBC 蛋白的基本理化性质、序列比对和

进化分析 运用 ProtParam 在线软件（http://web.

expasy.org/protparam/）分析预测 LcUBC 蛋白序列

的分子量、等电点、不稳定系数、脂肪指数和疏

水性等基本的理化性质；采用 Plant-mPLoc Server

在线软件（ http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/

plant-multi/#）分析 LcUBC 蛋白的亚细胞定位；

运用 MEME 4.12.0在线软件（http://meme.nbcr.net/

meme/）分析 LcUBC 家族蛋白的保守基序，参数

设置：基序的最大数目设置为 10, 基序长度设为

6~150 个氨基酸，其他参数为默认值。通过 MEGA

6.0 的 MUSCLE 程序比对氨基酸多重序列，参数

为程序默认参数。利用多重序列比对产生的

LcUBC 保守结构域 145 个氨基酸残基后续进行

NJ（Neighbor-Joining）分析。采用 MEGA 6.0 软

件构建进化树，Bootstrap 值设为 1000 次重复，以

获得更为可靠的分支聚类，其他参数为默认参数。

1.2.3 LcUBC 基因家族在花穗调控下的表达特

征分析 选择树龄相同、长势相近的‘妃子笑’

荔枝树，分别选取荔枝树的不同组织如嫩叶、根、

茎、老叶、雌花、雄花、果肉、果皮、种子，液

氮速冻后存放于–80℃冰箱中，用于 RNA 的提取。

花穗处理：选择树龄相同、长势相近的‘妃

子笑’荔枝树，当花穗长度抽生至约 18 cm 时，

进行如下操作：（1）对照组（CK），不做任何

处理；（2）烯效唑（Un）处理，用 50 mg/L 烯

效唑（品牌：四川国光，有效成分含量 5%）喷施，

喷至叶面滴水；分别取对照及烯效唑处理后 0、7、

14、21、28、35、42 d 的花穗，液氮速冻后存放

于–80℃冰箱中，用于 RNA 的提取。

选用前期课题组筛选的 LcActin 为内参，根据

转录组中注释的 LcUBC 的核苷酸序列，利用在线

第 5 期 董 晨等：基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 885

软件 Primer 3 plus 设计荧光定量引物（表 1），

通过 Blast 分析引物的特异性，引物序列委托广州

艾基生物技术有限公司合成。将处理好的材料按

照 RNA 提取标准进行磨样，采用华越洋生物科技

有限公司 RAN 提取试剂盒 QK 型，分别对根、茎、

嫩叶、老叶、雌花、雄花、果肉、果皮、种子和

花穗的总 RNA 进行提取，提取 1 μL 检测 RNA 的

质量和浓度，样品符合要求后利用 M-MLV 逆转

录酶（TaKaRa）反转录合成 cDNA。qPCR 分析

采用 SYBR Premix Ex Taq™（TaKaRa）试剂盒，

Roche480Ⅱ定量 PCR 系统（瑞士），采用 384 孔

板，qPCR 反应体系为 10 μL，其中 cDNA 1 μL（相

当于 25 ng 总 RNA），10 µmol/L 基因特异性引物

1 µL，2×SYBR Premix ExTaq 5 μL，最后用 ddH2O

补足 10 μL。qPCR 反应条件：50℃预变性 2 min，

95℃预变性 2 min；95℃变性 15 s，56℃退火 15 s，

72℃延伸 30 s，共 55 个循环。每个样品 3 个重复。

采用 2–CT法计算基因相对表达量。

表 1 LcUBC 基因家族引物序列

Tab. 1 Primer sequences of LcUBC gene family

基因 Gene ID 正向引物（5–3）Forward primer (5–3) 反向引物（5–3）Reverse primer (5–3)

LcUBC1 Unigene0001844 TCGTACAGTTGGAGGCTTGT TGCAAGGAAGAGGCTGATGA

LcUBC2 Unigene0001927 TTCGAAATGGTCAGTGCTGG TTGGCAAGCGACGATAATGG

LcUBC3 Unigene0003053 AGCTAGCTGTGTGACCATCA ACCTCAGCCCTGGAAAGAAA

LcUBC4 Unigene0003214 GAAAGGTGATGCTGGTGGTG GCCCTCAGAAGTCCAATCCT

LcUBC5 Unigene0010286 TCTCAAGCAAGGGAATCGGT ATGAGGTCCCATGTGATGCA

LcUBC6 Unigene0014473 CAGGAGGTCAAGGAGATGCA ACGGGTACTCAGCAGGTAAC

LcUBC7 Unigene0014483 CATTTGCCTCCTGACCCATG GCTACTGCCTCATCACTGGA

LcUBC8 Unigene0014555 GGGAGGGCTGTTGGGATAAT ATTCATGGCAGCGTCTCAAG

LcUBC9 Unigene0015820 GGTTGTTTCGTCCAGCACAT TGGGTTTGGATCTGTGAGCA

LcUBC10 Unigene0016542 ATTGACCGAGGGCTCTGAAA ACTCTTCCCATTTGCCCAGA

LcUBC11 Unigene0029596 CACCTGCTTCCATCCCAATG TGTGCTGCTTGGCTGTTTAG

LcUBC12 Unigene0032422 ATCCTCCTACCTCTTGCAGC CCTTTGTCCTGAATGCGACC

LcUBC13 Unigene0032423 TAGTCCTTACGCTGGTGGTG ACCAATGGATCATCGGGGTT

LcUBC14 Unigene0033691 GTGATCGAAGTCAACGGAGC CTAACAGTCATGGCAGGGGA

LcUBC15 Unigene0034885 TGCTTCGGTTTCTCAGAGGT TGGATGGAAGCACATGGTCT

LcUBC16 Unigene0035356 ACGAAGGAGGTGTCTGGAAA TACCAAACATCGGGCTCCAT

LcUBC17 Unigene0036703 CCTCTCTTTTCCAATGCCCG ACATGTCATCAGCCACAGGA

LcUBC18 Unigene0038283 AGCGGACTTCTTCTCCCAAA TGAGCCTTTTGAACACGTGG

LcUBC19 Unigene0039504 CGAAGCAACAAACTGGACCA GTGAAACCATCCCATCTGCC

LcUBC20 Unigene0039859 AGGAACTCACAGATCTCGGC GGCTTGAAGGGGTAGTCTGT

LcUBC21 Unigene0039860 CTCAAGCGCATCAACAAGGA AGTCTGTGGGGAAGTGGATG

LcUBC22 Unigene0042419 AAATTCTGCGATCCTGTGCC AGATTCCCTCCTCCGCTTTC

LcUBC23 Unigene0042906 TGTCTGCACCTGAACCTGAT CACCACCGACAGCTTCTAGA

LcUBC24 Unigene0043251 CTCCGAGAAATGGCCAACAG AATCGAACCTTTGGAGCAGC

LcUBC25 Unigene0044469 GGAGCTAGTGGTGATGGTGA CATGCCAGGATTTACACCGG

LcUBC26 Unigene0050724 GGAATTGCAGAAATGGCCGA GCAACAATAAGCGTGCAGTC

LcUBC27 Unigene0051029 AGAGTTCTGTGACCAAGCGA CAGAAGAAGTTGTGGCCGAA

LcUBC28 Unigene0052502 TCTGTGTCATGAACCGTCCA ATGTTGTTGCACGTCCTTCC

2 结果与分析

2.1 LcUBC 基因家族的鉴定

首先对转录组数据库的本地 Blast 进行比对

检索和关键词搜素，再通过 SMART 对保守结构

域进行筛选，最终得到 28 条 LcUBC 蛋白序列。

为了便于研究，按照转录组中的基因 ID 大小前后

顺序统一为 LcUBC 蛋白编号为 LcUBC 1~LcUBC

28（表 2），对应所编码的氨基酸数分布在 85~

886 热带作物学报 第 43 卷

1149 aa 之间；预测的理论分子量大小范围在

9.668~102.307 kDa 之间。等电点大小范围在

4.03~9.61 之间，其中 18 个 LcUBC 蛋白的等电

点小于 7，显酸性；10 个 LcUBC 蛋白等电点大于

7，显碱性；LcUBC 蛋白平均等电点小于 7，表明

UBC 蛋白为弱酸性，在酸性的亚细胞环境中发挥

作用。不稳定指数分析结果发现，5 个 LcUBC 蛋

白（LcUBC 4、LcUBC 9、LcUBC 18、LcUBC 23

和 LcUBC 25）的不稳定指数小于 40，为稳定蛋

白，其余均为不稳定蛋白。平均亲水系数结果表

明，除了 LcUBC 4 蛋白疏水，其余均为亲水蛋白。

亚细胞定位分析结果表明，LcUBC 7 和 LcUBC 16

蛋白定位于细胞质，LcUBC 1 和 LcUBC 24 蛋白

定位于细胞质和细胞核，LcUBC 6 蛋白定位于内

质网，其余蛋白均定位于细胞核。综合上述分析

结果，无论从氨基酸序列的长度还是蛋白的特性

变化分析，LcUBC 蛋白都有很大差异，这表明

LcUBC 基因家族蛋白具有不同特性。

表 2 LcUBC 基因家族信息

Tab. 2 LcUBC gene family information

基因

Gene

转录组 ID

Transcriptome ID

UBC 结构域

UBC

domain

蛋白长度

Protein

length/aa

分子量

Molecular

weight/Da

等电点

pI

不稳定指数

Instability

index

脂肪系数

Aliphatic

indexr

平均亲水系数

Average hydrophilic coefficient

亚细胞定位

Subcellular

localization

LcUBC1 Unigene0001844 11-154 156 17 792.11 5.83 69.97 70.06 –0.568 Cytoplasm,

Nucleus

LcUBC2 Unigene0001927 4-147 148 16 492.06 7.72 45.84 77.16 –0.272 Nucleus

LcUBC3 Unigene0003053 1-68 104 11 765.79 4.03 42.97 69.42 –0.830 Nucleus

LcUBC4 Unigene0003214 5-170 260 29 379.26 8.29 33.19 84.69 0.002 Nucleus

LcUBC5 Unigene0010286 1-153 282 31 162.01 5.64 48.65 76.77 –0.651 Nucleus

LcUBC6 Unigene0014473 14-174 276 31 084.15 5.25 57.42 72.83 –0.629 Endoplasmic

reticulum

LcUBC7 Unigene0014483 4-145 145 16 772.25 4.86 47.28 69.79 –0.401 Cytoplasm

LcUBC8 Unigene0014555 6-163 165 18 454.92 5.20 47.60 77.94 –0.353 Nucleus

LcUBC9 Unigene0015820 3-84 85 9 668.18 7.99 37.45 91.76 –0.165 Nucleus

LcUBC10 Unigene0016542 676-833 916 102 307.90 4.79 40.20 77.14 –0.336 Nucleus

LcUBC11 Unigene0029596 36-178 178 19 701.27 5.02 62.66 75.62 –0.363 Nucleus

LcUBC12 Unigene0032422 4-147 148 16 548.13 7.72 49.03 75.81 –0.312 Nucleus

LcUBC13 Unigene0032423 4-147 148 16 575.15 7.72 48.49 75.81 –0.330 Nucleus

LcUBC14 Unigene0033691 18-161 161 18 341.88 8.35 68.35 76.89 –0.455 Nucleus

LcUBC15 Unigene0034885 38-181 185 20 677.37 5.58 56.17 66.92 –0.470 Nucleus

LcUBC16 Unigene0035356 3-96 97 11 042.66 5.02 49.56 76.19 –0.327 Cytoplasm

LcUBC17 Unigene0036703 4-147 148 16 498.07 7.68 44.66 80.41 –0.267 Nucleus

LcUBC18 Unigene0038283 61-218 351 39 250.80 9.49 37.79 80.83 –0.326 Nucleus

LcUBC19 Unigene0039504 895-1055 1146 126 438.45 4.57 40.24 75.75 –0.570 Nucleus

LcUBC20 Unigene0039859 4-147 147 16 495.81 6.40 41.47 79.66 –0.324 Nucleus

LcUBC21 Unigene0039860 4-115 115 12 662.53 6.23 44.45 83.13 –0.131 Nucleus

LcUBC22 Unigene0042419 299-484 581 64 792.80 5.30 46.48 77.30 –0.350 Nucleus

LcUBC23 Unigene0042906 5-150 193 21 076.06 4.72 37.71 89.90 –0.129 Nucleus

LcUBC24 Unigene0043251 8-151 153 17 205.85 6.74 49.03 92.55 –0.319 Cytoplasm,

Nucleus

LcUBC25 Unigene0044469 2-81 195 20 831.02 9.61 38.30 89.69 –0.268 Nucleus

LcUBC26 Unigene0050724 18-130 130 14 519.60 6.16 58.43 89.23 –0.135 Nucleus

LcUBC27 Unigene0051029 30-178 209 24 455.55 4.44 50.54 81.58 –0.330 Nucleus

LcUBC28 Unigene0052502 8-162 238 27 166.31 9.07 59.69 66.30 –0.511 Nucleus

第 5 期 董 晨等：基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 887

2.2 LcUBC 基因家族蛋白保守基序分析

通过多重序列比对 LcUBC 基因家族的氨基

酸序列全长，比较不同 LcUBC 家族成员间 UBC

保守结构域的特点（图 1），多重序列比对中，

28 个 LcUBC 基因均含有进化上高度保守的氨基

酸残基半胱氨酸的活性位点，位于半胱氨酸活性

位点后的 C-端色氨酸（W）在 28 个 LcUBC 蛋白

中也高度保守，“HPNI”保守基序位于半胱氨酸

活性位点之前的 7~10 位氨基酸。

图 1 LcUBC 基因家族成员蛋白保守区的

多重序列比对分析

Fig. 1 Multiple sequence alignment analysis of LcUBC

gene family members conserved regions

通过在线软件 MEME 分析 LcUBC 蛋白中的

保守基序，结果见图 2。预测 LcUBC 基因家族中

含有 10 个保守基序，LcUBC 基因家族成员之间

所包含的保守基序数目及种类存在一定的差异。

在 LcUBC 基因家族中有 25 个成员含 Motif 1 基

序，有 15 个成员含 Motif 2 基序。通过 SMART

分析 Motif 1、Motif 2 为 LcUBC 蛋白结构域中非

常重要的保守基序。

为进一步了解 LcUBC 基因家族成员之间的

进化关系，利用模式物种拟南芥中的 37 个 AtUBC

和酵母中的 13 个 ScUBC 同荔枝中的 28 个 LcUBC

构建系统进化树（图 3），结果表明，荔枝中的

28 个 LcUBC 分为 10 个亚家族，分别为 UBC1、

UBC2/11、UBC3/7、UBC4/5、UBC6、UBC8、

UBC10/12、UBC13、UBC14、UBC15，其中 UBC14

和 UBC15 在酵母基因组中缺失，推测 UBC14 和

UBC15 是植物中特有的或是酵母进化过程中丢失。

2.3 LcUBC 基因家族时空表达分析

UBC 参与 DNA 的损失修复、生长、发育及

胁迫响应等方面，为了研究 LcUBC 基因家族在不

同发育过程中的功能，分析 9 个不同组织（如嫩

叶、嫩茎、果皮、种子、根、雄花、老叶、雌花、

果肉）中 LcUBC 基因的表达情况（图 4）。在植

物正常的发育过程中，不是所有的 UBC 基因在不

同组织部位都表达，28 个 LcUBC 基因家族成员

中至少在某一个组织部位表达（图 5），推测这

些基因有可能是在生物胁迫或非生物胁迫条件下

表达。其中，LcUBC4、LcUBC5、LcUBC18 在种

子中的表达显著高于其他组织，LcUBC7 在雄花

中的表达上显著较高于其他组织，LcUBC14、

LcUBC15 在雌花中的表达量显著高于其他组织，

LcUBC10 在果皮和老叶中高表达。

2.4 LcUBC 基因家族在花穗调控表达模式

利用 qPCR 分析 LcUBC 基因家族在荔枝花穗

调控的表达量（图 5），结果表明，与对照相比，

LcUBC 基因家族在烯效唑处理后表达量存在显

著变化，经烯效唑处理后，LcUBC27 在 7、14、

21、28、35 d 表达量上调，LcUBC2、LcUBC7、

LcUBC12 、 LcUBC13 、 LcUBC15 、 LcUBC16 、

LcUBC17、LcUBC28 在 21 d 表达量最高，LcUBC

20、LcUBC21 在 35 d 表达量最高，LcUBC16 表

达呈现先上升后下降的趋势，在 21 d 表达量最高。

LcUBC12、LcUBC 23、LcUBC24、LcUBC25 与对

照相比表达有变化，但差异不显著。

3 讨论

本研究参考拟南芥和水稻 UBC 家族基因的

信息，基于烯效唑处理荔枝花穗转录组数据，利

用生物信息学方法全面分析鉴定 LcUBC 基因家

族。结果共鉴定出 28 个 LcUBC 基因家族成员，

并对其基本理化性质、亚细胞定位进行了分析。

通过对 LcUBC 基因家族蛋白保守结构域分析可

看出，LcUBC 蛋白的结构域具有高度的保守性，

包含典型的保守结构域 UBC domain，且含有半胱

氨酸活性位点，这与香蕉中 UBC 蛋白的分析结果

一致[14]。

888 热带作物学报 第 43 卷

A：LcUBC 保守基序位置；B：保守基序序列。

A: Conserved motif location of LcUBC; B: Conserved motif consensus.

图 2 LcUBC 基因家族成员保守基序分析

Fig. 2 Distribution of conserved motifs in LcUBC gene family members

第 5 期 董 晨等：基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 889

图 3 荔枝、拟南芥和酵母中 UBC 的邻接法系统进化树

Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of UBC in Litchi, Arabidopsis and Yeast

图 4 LcUBC 基因家族时空表达分析

Fig. 4 Spatiotemporal expression analysis of LcUBC gene family

890 热带作物学报 第 43 卷

*表示差异显著（P<0.05）。

* indicates significant difference (P<0.05).

图 5 烯效唑处理花穗发育不同时期 LcUBC 基因家族表达分析

Fig. 5 Analysis of LcUBC gene family expression at different stages of flower panicle development in uniconazole treatment

第 5 期 董 晨等：基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析 891

通过转录组及 qPCR 的结果分析，在荔枝的

时空表达和烯效唑处理后的花穗调控中，大多数

LcUBC 基因家族的表达水平发生了变化，推测这

些基因很可能通过参与激素信号转导途径或调控

果实相关转录因子的水平，进而影响荔枝果实成

熟过程中的各种生理变化。LcUBC 4、LcUBC 5、

LcUBC8、LcUBC18、LcUBC19 在种子中表达量

较高，推测这 5 个 LcUBC 家族基因在果实种子发

育过程中发挥着重要的作用； LcUBC 6 、

LcUBC14、LcUBC15、LcUBC23、LcUBC24 在雌

花中表达量较高，LcUBC 7、LcUBC 26 在雄花中

表达量较高，推测这 7 个 LcUBC 家族基因在果实

花发育过程中发挥着重要的作用；LcUBC 10、

LcUBC12、LcUBC18、LcUBC27 在老叶中表达量

较高，而 LcUBC 13、LcUBC17、LcUBC20、

LcUBC21 在果皮中表达量较高。多个 LcUBC 家

族基因的表达水平在烯效唑处理后第 21 天的表

达量较高，这表明 LcUBC 基因家族在该时期调控

荔枝花穗发育过程中发挥着关键作用。该研究结

果为进一步研究 LcUBC 基因家族的生物学功能

奠定了坚实的基础。

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热带作物学报 2022, 43(5): 893903

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2021-12-14；修回日期 2022-01-09

基金项目 国家自然科学基金项目（No. 32060667）；赣南师范大学研究生创新基金项目（No. YCX20A016）。

作者简介 刘林芝（1997—），女，硕士研究生，研究方向：果树遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：陈健美（CHEN

Jianmei），E-mail：chen_jm09@hotmail.com。

‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究

刘林芝1

，欧阳欢1

，李兴涛1,2，陈健美1,2*

1. 赣南师范大学生命科学学院，江西赣州 341000；2. 国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州 341000

摘 要：我国脐橙产区的季节性干旱对脐橙产量和品质影响较大。‘赣南早’脐橙作为一个新品种脐橙，目前在我国脐

橙产区已大面积推广。为深入了解这个新品种的耐旱性，探究早熟品种‘赣南早’脐橙应对干旱胁迫的调控机制，以

‘赣南早’脐橙与‘纽荷尔’脐橙（对照）为材料，测定比较不同干旱胁迫程度下二者光合作用、干旱相关生理指标

等差异，并通过 RNA-Seq 分析比较转录水平差异及抗氧化物酶基因表达调控。结果表明：干旱胁迫下‘赣南早’脐橙

净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）均显著高于‘纽荷尔’脐橙；随着干旱胁迫程度增加，‘赣南早’

脐橙叶片较‘纽荷尔’脐橙更舒展，‘赣南早’脐橙相对电导率和丙二醛含量显著低于‘纽荷尔’脐橙，而保护酶超氧

化物歧化酶（SOD）和过氧化物歧化酶（POD）活性变化幅度更大；‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙叶片可溶性糖含

量无显著性差异，复水后，‘纽荷尔’脐橙叶片中可溶性糖含量极显著高于‘赣南早’脐橙。转录组测序分析表明，干

旱胁迫 0、10、20 d 时，‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙间 DEGs 数量分别为 1266、683、658 个。GO 富集分析显示，

在干旱胁迫过程中‘赣南早’脐橙差异基因主要集中在细胞蛋白修饰过程、高分子修饰作用、含磷化合物代谢过程、

蛋白修饰过程等通路，而‘纽荷尔’脐橙未见明显富集。KEGG 富集分析显示，除了富集于淀粉及蔗糖通路和氨基酸

及核苷酸糖代谢途径，‘赣南早’脐橙其他差异基因富集途径与‘纽荷尔’脐橙基本一致。差异基因转录因子分析显示

二者在 ERF 家族、MYB 家族、NAC 家族、MYB_related 家族、WRKY 家族、bHLH 家族、HB-other 家族、HSF 家族、

B3 家族和 bZIP 家族均有分布，此外，‘赣南早’脐橙特异分布于 GRAS 家族。根据转录组分析筛选出抗氧化酶相关基

因 30 个，其中上调表达 48%，下调表达 52%。本研究结果为‘赣南早’响应干旱胁迫的生理变化提供理论依据，并为

其抗旱性研究提供分子基础。

关键词：脐橙；干旱胁迫；光合作用；酶活性；丙二醛；转录组分析

中图分类号：S666.4 文献标识码：A

Physiological and Transcriptome Analysis of ‘Gannan Zao’ Navel

Orange under Drought Stress

LIU Linzhi1

, OUYANG Huan1

, LI Xingtao1,2, CHEN Jianmei1,2*

1. School of Life Sciences, Gannan Normal University, Ganzhou, Jiangxi 341000, China; 2. National Navel Orange Engineering

Research Center, Ganzhou, Jiangxi 341000, China

Abstract: The seasonal drought in the navel orange producing areas in China has a great impact on the yield and quality

of navel orange. ‘Gannan zao’ navel orange, a new variety, is widely popularized in navel orange producing areas in

China. In order to deeply understand the drought tolerance of ‘Gannan zao’ and explore its regulation mechanism on

drought stress, the differences of photosynthesis and drought related physiological indexes between ‘Gannan zao’ and

‘Newhall’ under different drought stress were measured, and the transcriptional differences and the regulation of antioxidant enzyme gene expression were compared by RNA-seq analysis. The results showed that the net photosynthetic

rate (Pn), stomatal conductance (Gs) and transpiration rate (Tr) of ‘Gannan zao’ were significantly higher than those of

‘Newhall’ under drought stress. With the increase of drought stress, the leaves of ‘Gannan zao’ were more stretched than

894 热带作物学报 第 43 卷

that of ‘Newhall’, and the relative conductivity and malondialdehyde content of ‘Gannan zao’ were significantly lower

than that of ‘Newhall’, while the activities of protective enzymes superoxide dismutase and peroxide dismutase changed

more. There was no significant difference in soluble sugar content between ‘Gannan zao’ and ‘Newhall’. After rehydration, the soluble sugar content of ‘Newhall’ was significantly higher than that of ‘Gannan zao’ . Transcriptome sequencing analysis showed that the number of DEGs between ‘Gannan Zao’ and ‘Newhall’ was 1266, 683 and 658 respectively at 0, 10 and 20 days of drought stress. Go enrichment analysis showed that the differential genes of ‘Gannan

zao’ were mainly concentrated in the process of cell protein modification, protein modification, polymer modification

and phosphorus compound metabolism, while ‘Newhall’ was not significantly enriched. KEGG enrichment analysis

showed that the differential gene concentration pathways of ‘Gannan Zao’ and ‘Newhall’ were basically the same, while

‘Gannan zao’ was also enriched in starch and sucrose pathway and amino acid and nucleotide sugar metabolism pathway.

‘Gannan zao’ was also enriched in starch and sucrose pathway and amino acid and nucleotide sugar metabolism pathway.

Both transcription factors were in ERF family, MYB family, NAC family, MYB_Related family, WRKY family, bHLH

family, HB-other family, HSF family, B3 family and bZIP family were distributed. In addition, ‘Gannan zao’ was specifically distributed in GRAS family. According to the transcriptome molecular results, 30 antioxidant enzyme related

genes were screened, of which 48% were up-regulated and 52% were down regulated. The results of this study would

provide a theoretical basis for the physiological changes of gannanzao in response to drought stress, and provide a molecular basis for the study of its drought resistance.

Keywords: navel orange; drought stress; photosynthesis; enzymatic activity; malondialdehyde; transcriptome analysis

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.003

柑橘（Citrus L.）是芸香科、柑橘属植物，是

世界上种植面积和产量最大的水果。我国是柑橘

的主要原产国之一，正逐渐向区域化、商品化、

良种化、专业化、集约化等方向发展[1]。以赣南

脐橙为主的江西优势柑橘产业带，季节性干旱频

率较高，危害严重，引起柑橘产量和品质下降，

是柑橘生产上亟待解决的问题之一[2]。水分是柑

橘生长过程中的必要条件[3]。当植物体处于干旱

胁迫环境条件下时，可以通过气孔关闭减少水分

蒸发，调节可溶性糖含量，以保证植株正常代谢，

抵抗逆境带来的危害[4]。随着干旱胁迫程度增加，

植物细胞膜过氧化程度增加，丙二醛

（ malonaldehyde, MDA ）、超氧化物歧化酶

（superoxide dismutase, SOD）和过氧化物歧化酶

（peroxidase, POD）等保护酶可以反应植物对干

旱胁迫的耐受程度[5]。不同的植物其生理物质的

活性和含量在干旱胁迫条件下存在差异，有关‘赣

南早’脐橙在此方面的研究尚未见报道。‘赣南早’

脐橙（‘Gannan Zao’navel orange, GNZ）是从‘纽

荷尔’脐橙（‘Newhall’navel orange, NHE）中选

育的芽变品种，有其独特的品质，具有转色快、

糖积累快、低酸等特性[6]，比目前主栽品种‘纽

荷尔’脐橙早熟 30 d 以上[7]，‘赣南早’脐橙是脐

橙主产区用于品种结构调整的一个优良早熟品

种，在脐橙产区种植面积已超 6666.67 hm2

。本研

究以‘赣南早’脐橙与其对照‘纽荷尔’脐橙为

材料，研究二者在干旱胁迫下的主要生理指标响

应差异，并进一步分析其抗旱能力及基因表达差

异。本研究有助于深入了解‘赣南早’脐橙抗旱

性，为新品种‘赣南早’脐橙的栽培技术与大面

积推广提供参考，同时为柑橘抗旱遗传改良提供

重要的基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 自然干旱试验材料‘赣南早’

（Gannan Zao, GNZ）脐橙和‘纽荷尔’（Newhall,

NHE）脐橙种植于江西省赣州市信丰县正平镇‘赣

南早’脐橙基地，为 4 年生枳壳砧脐橙树，同排

种植，每个品种各选 3 株。盆栽控水干旱试验材

料来自赣南师范大学国家脐橙工程技术研究中心

柑橘种质资源圃，是‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’

脐橙枳壳砧一年半生苗，每个品种各 20 株苗。对

自然干旱材料进行光合指标测定，生理及转录组

分析材料均取自盆栽控水干旱试验材料，生理指标

测定材料于干旱处理 0、5、10、15、20 d 和复水 5 d

（F5）时取‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙成熟枝

条叶片，转录组测序分析材料取干旱处理 0、10、

20 d 的叶片。样品液氮速冻后，迅速带回实验室

–80℃保存备用，以上取样均设置 3 次生物学重复。

1.1.2 干旱处理 自然干旱处理为 2019 年 9—11

月田间自然干旱 60 d 进行光合指标测定，期间赣

第 5 期 刘林芝等：‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究 895

南地区连续无超 10 mm 降水且试验用树未人工施

水，复水 5 d 后再次测定。盆栽控水干旱处理材

料生长环境一致（盆高 38 cm，直径 25 cm，基质

为园土∶甜叶菊渣∶沙土=1∶1∶1），正常管理 6

个月后，在处理前正常浇水 3 d，最后一次浇透水

后进行控水处理，分别处理 0、5、10、15、20 d，

干旱处理 20 d 后复水 5 d，并拍照记录叶片形态。

1.2 方法

1.2.1 生理指标测定 光合作用参数净光合速率

（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间 CO2 浓度（Ci）和蒸

腾速率（Tr）使用 Li-6400XT 便携式光合仪测定，

设定空气流速为 500 mol/s，CO2浓度 400 μmol/mol。

相对电导率、丙二醛及叶片可溶性糖含量测定操

作参考《植物生理学实验指导》[8]，用电导率仪

（雷磁 DDS-307，上海）测定相对电导率值。分

别用硫代巴比妥酸法、蒽酮比色法检测并计算丙

二醛和可溶性糖含量[9]，超氧化物歧化酶、过氧化

物酶活性测定[9]采用氮蓝四唑法和愈创木酚法。

1.2.2 转录组测序 由美吉生物科技有限公司

（上海，中国）对‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’

脐橙干旱处理 0、10、20 d 叶片，共 18 个样品进

行转录组分析，以甜橙基因组为参考基因组进行

序列比对分析。参考基因组来源：Citrus_sinensis,

http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.ph

p，参考基因组版本：hzau。Illumina 平台通过将

测序图像信号经 CASAVA 碱基识别（base calling）

转换成文字信号，并将其以 fastq 格式储存起来作

为原始数据。根据 index 序列区分各个样本的数

据，以便进行后续分析。原始数据已上传 NCBI

数据库，SubmissionID:SUB10857158，BioProjectID:

PRJNA792482。

1.2.3 转录数据质量控制 为保证后续分析的准

确性，使用 SeqPrep 和 Sickle 软件处理原始数据，

去除 reads 中的接头序列，将序列末端（3'端）低

质量（质量值小于 20）的碱基修剪掉，如剩余序

列中仍然有质量值小于 10 的碱基，则将整条序列

剔除，去除含 N（模块碱基）的 reads，舍弃去

adapter 及质量修剪后长度小于 30 bp 的序列，并

对质控后的数据进行质量评估。

1.2.4 转录数据分析 利用表达定量软件 RSEM

分别对转录本的表达水平进行定量分析，差异基

因表达量及筛选，使用 DESeq2 软件对样本进行

分析，参数：P-adjust<0.05 & |log2FC|≥1。采用

软件 Goatools 对 DEGs 进行 GO 富集分析，Fisher

精确检验，用 Bonferroni 方法对 P 值进行校正，P

值（FDR）<0.05。采用 R 脚本对差异基因进行

KEGG PATHWAY 富集分析，Fisher 精确检验，P

值（corrected P-value）以 0.05 为阈值，满足此条

件的 KEGG 通路定义为在基因集中显著富集的

KEGG 通路。采用 PlantTFDB 4.0（http://planttfdb.

cbi.pku.edu.cn/）对差异基因进行转录因子分析。

1.3 数据处理

利用 Microsoft Excel 2007 软件对实验数据进

行整理、分析和作图，并用 SPSS Statistical 23.0

软件分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 自然干旱胁迫下‘赣南早’和‘纽荷尔’

脐橙叶片形态及光合指标差异

叶片卷曲程度是植物受干旱胁迫最直观的表

现，从表型观察来看（图 1），干旱胁迫 15 d 时，

‘纽荷尔’脐橙叶片已出现卷曲，但‘赣南早’

脐橙叶片仍舒展，在干旱胁迫 20 d 时，‘赣南早’

脐橙叶片出现轻微卷曲，‘纽荷尔’脐橙叶片卷曲

程度更加严重，复水后叶片均恢复舒展。

A：干旱胁迫 0 d；B：干旱胁迫 15 d；C：干旱胁迫 20 d；

D：复水 5 d；左为‘赣南早’脐橙；右为‘纽荷尔’脐橙。

A: 0 d of drought stress; B: 15 d of drought stress; C: 20 d of drought

stress; D: 5 d of after watering; Left: ‘Gannanzao’; Right: ‘Newhall’.

图 1 干旱胁迫下‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’

脐橙叶片形态变化

Fig. 1 Morphological changes of ‘Gannanzao’ and

‘Newhall’ leaves under drought stress

在自然干旱 60 d 时测定田间‘赣南早’脐橙

和‘纽荷尔’脐橙叶片净光合速率（Pn）、气孔导

度（Gs）、胞间 CO2 浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr），

896 热带作物学报 第 43 卷

与复水后光合作用参数，结果表明，自然干旱下‘赣

南早’脐橙的 Gs 和 Tr 值极显著高于‘纽荷尔’脐

橙，Pn 显著高于‘纽荷尔’脐橙。复水后,‘赣南

早’脐橙的 Pn 值极显著高于‘纽荷尔’脐橙，‘赣

南早’脐橙的 Tr 值显著高于‘纽荷尔’脐橙，而

Gs、Ci 值无显著性差异（表 1）。

表 1 自然干旱对‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙光合特性的影响

Tab. 1 Effect of natural drought on photosynthetic characteristics of ‘Gannanzao’ and ‘Newhall’

指标 自然干旱 Natural drought 复水后 After watering

Index GNZ NHE GNZ NHE

Pn/(μmol·m-2·s–1) 3.08±0.44aA 1.96±0.3bA 3.46±0.06aA 2.28±0.28bB

Gs/(mmol·m-2·s–1) 0.05±0.01aA 0.04±0.00bB 0.06±0.01aA 0.05±0.00aA

Ci/(μmol·mol-1) 301.51±7.06aA 314.87±22.75aA 268.36±3.14aA 281.65±9.85aA

Tr/(mmol·m-2·s–1) 1.36±0.19aA 0.74±0.06bB 2.16±0.10aA 1.75±0.15bA

注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05），不同大写字母表示处理间差异极显著（P<0.01）。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05), different capital letters indicate extremely

significant difference among treatments (P<0.01).

2.2 干旱胁迫下‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙

叶片电导率、丙二醛及可溶性固形物含量

相对电导率、丙二醛含量等可判断柑橘干旱

胁迫下细胞膜受损伤程度。结果表明，干旱处理

前‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙叶片相对电导率

差异不显著，干旱处理中二者相对电导率值均呈

上升趋势，且在复水后下降（图 2A）。在干旱胁

迫 10 d,‘纽荷尔’的相对电导率显著高于‘赣南

早’脐橙，干旱胁迫 15、20 d 和复水 5 d 后极显

著高于‘赣南早’脐橙。

如图 2B 所示，干旱处理下，‘纽荷尔’脐橙

叶片丙二醛含量呈上升趋势，而‘赣南早’脐橙

在干旱胁迫 5~10 d 时呈下降趋势，后又迅速积累。

干旱胁迫 0、10、15 d 时‘纽荷尔’脐橙的丙二

醛含量极显著高于‘赣南早’脐橙，干旱胁迫 5、

20 d 时‘赣南早’脐橙丙二醛含量显著高于‘纽

荷尔’脐橙，复水后均下降。

可溶性糖含量检测结果表明（图 2C），二者

叶片可溶性糖含量在干旱胁迫 0~5 d 时呈下降趋

势，且‘纽荷尔’脐橙在干旱处理 15 d 时显著高

于‘赣南早’脐橙，二者在干旱胁迫 15、20 d 时

含量均增加，复水后均下降，但‘纽荷尔’脐橙

叶片可溶性糖含量极显著高于‘赣南早’脐橙。

2.3 干旱胁迫下‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙

叶片保护酶活性

保护酶活性检测结果表明（图 3A），在干旱

处理中，‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙叶片 SOD

活性均呈先降后升趋势，‘赣南早’叶片 SOD 活

性在干旱处理 5 d 后呈上升趋势，而‘纽荷尔’

脐橙在 10 d 后呈上升趋势，且均在复水后下降。

*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。

* indicates significant difference (P<0.05); ** indicates extremely

significant difference (P<0.01).

图 2 干旱胁迫下‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙相对

电导率、丙二醛及可溶性糖含量率变化

Fig. 2 Changes of relative conductivity malondialdehyde

and sugar content in ‘Gannanzao’ and ‘Newhall’ navel

oranges under drought stress

第 5 期 刘林芝等：‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究 897

*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。

* indicates significant difference (P<0.05); ** indicates

extremely significant difference (P<0.01).

图 3 干旱胁迫下‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙超氧

化物歧化酶、过氧化物酶活性变化

Fig. 3 Changes of superoxide dismutase and peroxidase

activity in ‘Gannanzao’ and ‘Newhall’ navel oranges

under drought stress

如图 3B 所示，在干旱处理 0 d 时，‘纽荷尔’

脐橙叶片 POD 活性显著高于‘赣南早’脐橙，0～

10 d 时 POD 活性均下降，10～20 d 时 POD 活性

均增强，且干旱处理 10、15 d 时‘赣南早’脐橙

叶片 POD 活性极显著高于‘纽荷尔’脐橙，复水

后，‘赣南早’脐橙叶片 POD 活性仍增强，而‘纽

荷尔’脐橙叶片 POD 活性下降。

2.4 测序数据质量控制

对‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙在干旱胁迫

0、10、20 d 下的 18 个转录组样本进行测序（表

2），共获得 130.96 Gb clean reads，各样本过滤后

碱基数均在 6.12 Gb 及以上，GC 含量均在 44.50%

左右，较稳定，Q20≥97.71%，Q30＞93.19%，错

误率在 0.025%左右，表明此测序结果及质控效果

较好，可用于后续转录组分析。

2.5 干旱胁迫下‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’

脐橙的差异表达基因

将干旱胁迫 0、10、20 d 的转录组测序数据

进行分析（图 4），在相同胁迫时间点进行比较，

‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙间获得了大量差异

表达基因（DEGs），分别为 1266、683、658 个，

表 2 转录组测序数据产出质量统计

Tab. 2 Quality statistics of transcriptome sequencing data

样品名称

Sample

原始序列数

Raw read

过滤后序列数

Clean read

碱基数

Clean base/Gb

错误率

Error rate/%

Phred>20

Q20/%

Phred>30

Q30/%

GC 含量

GC content/%

GNZ_0_1 51 359 358 50 985 206 7.47 0.0254 97.91 93.65 44.76

GNZ_0_2 50 552 560 50 118 592 7.37 0.0259 97.71 93.26 44.56

GNZ_0_3 56 535 868 56 126 824 8.21 0.0257 97.82 93.45 44.63

NHE_0_1 61 347 984 60 895 542 9.03 0.0256 97.86 93.52 44.85

NHE_0_2 47 599 880 47 010 238 6.80 0.0253 97.93 93.76 44.33

NHE_0_3 42 193 324 41 759 714 6.12 0.0257 97.80 93.46 44.61

GNZ_10_1 52 111 412 51 637 524 7.50 0.0255 97.89 93.59 43.88

GNZ_10_2 46 611 100 46 155 876 6.84 0.0255 97.89 93.62 44.47

GNZ_10_3 45 479 742 44 851 306 6.51 0.0256 97.82 93.48 44.20

NHE_10_1 50 619 036 50 078 660 7.29 0.0256 97.85 93.50 44.59

NHE_10_2 58 178 216 57 776 104 8.47 0.0254 97.93 93.68 44.85

NHE_10_3 53 321 202 52 970 064 7.79 0.0255 97.89 93.59 44.77

GNZ_20_1 44 621 436 44 170 308 6.47 0.0257 97.78 93.38 44.49

GNZ_20_2 42 590 002 42 099 056 6.19 0.0259 97.71 93.19 44.43

GNZ_20_3 45 842 592 45 350 394 6.59 0.0258 97.78 93.33 44.48

NHE_20_1 44 334 406 44 031 078 6.49 0.0259 97.75 93.22 44.38

NHE_20_2 60 104 364 59 082 032 8.47 0.0257 97.79 93.47 45.03

NHE_20_3 50 551 234 50 221 896 7.35 0.0256 97.83 93.45 44.50

注：_0、_10、_20 分别表示干旱胁迫 0、10、20 d。

Note:_ 0, _ 10, _ 20 represents drought treatment for 0 d, 10 d and 20 d respectively.

898 热带作物学报 第 43 卷

_0、_10、_20 分别表示干旱处理 0、10、20 d。

_ 0、_ 10、_ 20 represents drought treatment for 0 d,

10 d and 20 d respectively.

图 4 干旱胁迫下‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’

脐橙差异基因表达数量

Fig. 4 Number of differential gene expression between

‘Ganan zao’ and ‘Newhall’ under drought stress

其中上调基因数为 350、231、410 个，下调基因

数为 916、452、248 个。以干旱胁迫 0 d 为对照，

‘赣南早’脐橙在胁迫 10、20 d 时差异基因数为

3942、3304 个，‘纽荷尔’脐橙在胁迫 10、20 d

时分别有 236、2041 个差异表达基因。干旱胁迫

10 d 和 20 d 比较，‘赣南早’脐橙鉴定出 3752 个

差异表达基因，而‘纽荷尔’脐橙差异基因为 2108

个，以上筛选出的差异基因均为下调表达更多。

2.6 差异表达基因 GO 富集分析及 KEGG 富

集分析

为阐明差异表达基因行使的基因功能，采用

软件 Goatools 对差异基因进行 GO 富集分析，按

P-adjust<0.05 的条件选取 top20 的富集结果，干

旱胁迫 0 d 和 10 d 差异基因对比分析发现，‘赣南

早’脐橙 2 组间的差异基因主要集中在细胞蛋白

修饰过程（cellular protein modification process）、

蛋白修饰过程（protein modification process）、高

分子修饰作用（macromolecule modification）、含

磷化合物代谢过程（phosphate-containing compound metabolic process）、磷代谢过程（phosphorus

metabolic process）和小分子代谢过程（small

molecule metabolic process）（图 5A），而‘纽荷

尔’脐橙未见明显富集。干旱胁迫 0 d 与 20 d 差

异基因对比发现，‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙差

异基因均集中于生物学过程（biological process）。

此外，‘赣南早’脐橙还特异性富集于氧化还原酶

（oxidoreductase activity）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸

激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、磷酸化作用（phosphorylation）和氧己酸代

谢过程（oxoacid metabolic process）等通路中（图

5B、5C）。

图 5 ‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙差异基因 GO 分类

Fig. 5 GO classification of differential genes

in ‘Gannanzao’ and ‘Newhall’

第 5 期 刘林芝等：‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究 899

采用 R 脚本对样本差异基因进行 KEGG

PATHWAY 富集分析，功能分类及 PATHWAY 注

释显示（图 6），按 P-adjust<0.05 的条件选取 top20

的富集结果，干旱胁迫 0 d 和１0 d 差异基因对比

分析发现，‘赣南早’脐橙差异基因主要集中在植

物 MAPK 信号通路（MAPK signaling pathwayplant）、植物激素信号转导（plant hormone signal

transduction）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid

biosynthesis）（图 6A），而‘纽荷尔’脐橙主要集

中在苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成

（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）和

内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）通路（图 6C）。干旱胁迫 0 d 和 20 d

差异基因对比分析发现，‘赣南早’脐橙还富集在

植物-病原相互作用（plant-pathogen interaction）

通路中（图 6B），而‘纽荷尔’富集在光合作用

（photosynthesis）、光合生物的固碳作用（carbon

fixation in photosynthetic organisms）和糖酵解/

糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）途径（图 6D）。

此外，‘赣南早’脐橙特异性富集于淀粉及蔗糖通

路（starch and sucrose metabolism）和氨基酸及核

苷酸糖代谢（amio sugar and nucleotide sugar metabolism）途径。

2.7 转录因子分析及抗氧化保护酶相关基因

的转录调控

植物响应干旱胁迫过程中，转录因子

（transcription factor, TFs）发挥着重要的调控作

用。本研究对 4 组比较组获得的差异基因进行了

图 6 ‘赣南早’脐橙和‘纽荷尔’脐橙差异基因 KEGG 分类

Fig. 6 KEGG classification of differential genes in ‘Gannanzao’ and ‘Newhall’

900 热带作物学报 第 43 卷

转录因子分析，结果显示，‘赣南早’脐橙和‘纽

荷尔’脐橙转录因子在 ERF 家族、MYB 家族、

NAC 家族、MYB_related 家族、WRKY 家族、bHLH

家族、HB-other 家族、HSF 家族、B3 家族和 bZIP

家族均有分布。二者比较发现，‘纽荷尔’脐橙特

异性分布于 LBD（AS2/LOB）家族、ARF 家族和

AP2 家族，‘赣南早’脐橙特异性分布于 GRAS

家族。干旱胁迫 0 d 和 10 d 对比分析发现，‘赣南

早’脐橙差异基因主要分布于 ERF 家族（29 个）

（图 7A），‘纽荷尔’脐橙为 WRKY 家族（7 个）

（图 7C），干旱胁迫 0 d 和 20 d 对比分析表明，

‘赣南早’脐橙差异基因主要分布于 MYB 家族

（23 个）（图 7B），‘纽荷尔’脐橙为 bHLH 家族

（17 个）（图 7D）。

图 7 差异基因属转录因子家族分类

Fig. 7 Classification of differential gene genus transcription factor family

根据差异基因富集分析及转录因子分析结

果，从转录组差异表达基因中挖掘出 30 个编码抗

氧化保护酶基因（表 3），过氧化物酶（POD）基

因 Cs8g17370 、 Cs7g05450 、 Cs2g25450 和

Cs2g03110 等上调表达，Cs3g21730、Cs6g20170、

Cs7g19270、Cs1g18600 和 Cs9g05140 等下调表达。

编码抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase,

APX）基因 Cs8g17370 和 Cs7g05450 上调表达，

而 Cs7g05430 下调表达。编码超氧化物歧化酶

（SOD）基因 Cs8g15520 和过氧化氢酶（catalase,

CAT）基因 Cs3g27280 均下调表达。

3 讨论

净光合速率反应植物的光合能力的大小[10]，

随着净光合速率增大，植物消耗 CO2 量增大，胞

间 CO2 减少，植物就通过增大气孔导度获取更多

的 CO2

[11]。在自然干旱条件下，‘赣南早’脐橙净

光合速率及气孔导度均高于‘纽荷尔’脐橙，说

明‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的光合作用能力

强于‘纽荷尔’脐橙。通常细胞膜能维持细胞内

稳态，但干旱胁迫会导致植物细胞膜破坏导致大

量电解质外渗，因此可以根据植物在干旱胁迫下

的相对电导率来评估其抗旱性。同时，当植物在

逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛

是其产物之一，通常利用它表示植物对逆境反应

的强弱[12]。本研究结果表明，随着干旱胁迫天数

增加，‘赣南早’和‘纽荷尔’脐橙叶片相对电导

率值均上升，且‘赣南早’脐橙的相对电导率值

第 5 期 刘林芝等：‘赣南早’脐橙在干旱胁迫下的生理及转录组研究 901

表 3 抗氧化酶相关基因表达量

Tab. 3 Expression of antioxidant enzyme related genes

基因名称 GNZ GNZ

Gene name 0 d 10 d 20 d

基因名称

Gene name 0 d 10 d 20 d

Cs1g24640 0.09 0.64 0.60 orange1.1t02040 1.26 0.73 0.26

Cs2g03110 33.60 144.13 74.94 orange1.1t02041 2.28 3.73 0.74

Cs2g15310 0.53 0.08 0.00 orange1.1t02043 1.31 0.60 0.32

Cs2g25450 0.05 0.10 0.49 orange1.1t02044 4.08 1.42 0.49

Cs2g28110 0.90 0.82 2.37 orange1.1t02045 20.14 35.57 6.56

Cs3g21730 6.14 2.96 2.16 orange1.1t02046 42.71 157.12 27.67

Cs6g20170 4.49 1.49 1.45 orange1.1t04469 0.53 2.70 1.23

Cs7g05430 43.01 34.69 20.04 Cs7g05430 43.01 34.69 20.04

Cs7g05450 6.46 15.25 3.05 Cs7g05450 6.46 15.25 3.05

Cs7g19270 1.02 0.47 2.01 Cs8g17370 107.26 462.77 168.60

Cs7g30160 12.77 17.52 57.76 Cs8g15520 30.26 32.34 7.27

Cs8g17370 107.26 462.77 168.60 Cs3g27280 1538.84 771.55 458.64

Cs9g02030 0.09 0.20 1.13 Cs1g18600 4.82 4.26 1.47

Cs9g05140 0.68 0.33 0.00 Cs1g19890 1.09 1.77 3.30

orange1.1t01747 21.90 35.96 6.73 Cs1g20230 3.24 6.04 30.97

均低于‘纽荷尔’脐橙，说明干旱胁对‘纽荷尔’

脐橙叶片细胞损伤程度大于‘赣南早’脐橙。二

者叶片丙二醛含量也均呈上升趋势，在胁迫 10、

15 d 时‘纽荷尔’脐橙叶片丙二醛含量高于‘赣

南早’脐橙，说明‘纽荷尔’脐橙叶片膜脂过氧

化程度比‘赣南早’脐橙高，细胞膜受损更严重。

SOD、POD 是植物中防止膜脂过氧化的重要

酶，因此 SOD 和 POD 活性能较好地反映植物对

逆境的耐受能力[13-14]，植物为避免细胞遭到氧化

损伤，通过自我调节启动一系列抗氧化酶清除过

量的活性氧物质，超氧化物歧化酶（SOD）是第

一个参与植物细胞内活性氧清除的抗氧化酶，当

SOD 催化超氧根阴离子发生歧化反应后将产生

H2O2 和 O2，由 POD 和 CAT 等保护酶负责进一步

将 H2O2 分解成 H2O 和 O2

[15]。本研究发现，在干

旱胁迫 5 d 时‘赣南早’脐橙叶片 SOD 活性增强，

而‘纽荷尔’脐橙叶片 SOD 酶活性在干旱胁迫

10 d 时增强，且干旱胁迫 10 d 后‘赣南早’脐橙

叶片 SOD 活性显著高于‘纽荷尔’脐橙，而二者

叶片 POD 活性变化较为一致，干旱胁迫 10 d 后

活性均上升，且‘赣南早’脐橙叶片 POD 活性极

显著高于‘纽荷尔’脐橙，说明与‘纽荷尔’脐

橙相比，‘赣南早’脐橙对干旱胁迫环境刺激更敏

感，干旱胁迫加剧时，通过提高保护酶活性来抵

御干旱逆境能力更强。

转录因子通过调控靶基因表达，在植物抵抗

生物及非生物胁迫中起重要作用[16]。‘赣南早’

脐橙和‘纽荷尔’脐橙转录因子分析比较发现，

‘赣南早’脐橙特异性分布于 GRAS 家族，GRAS

家族基因具有促进分生组织发育，光敏信号传导

和 GA 代谢调节等作用[17]，说明‘赣南早’脐橙

抗干旱能力可能还与植物激素类代谢有关。干旱

胁迫 0 d 和 10 d 对比发现，‘赣南早’脐橙有 29

个差异基因分布于 ERF 家族，‘纽荷尔’脐橙有 7

个差异基因分布于 WRKY 家族。干旱胁迫 0 d 和

20 d 对比分析表明，‘赣南早’脐橙有 23 个差异

基因分布于 MYB 家族，‘纽荷尔’脐橙有 17 个

差异基因分布于 bHLH 家族。ERF 家族和 MYB

家族均为复杂的转录因子家族，不仅在种子萌发等

植物发育过程中起重要作用，而且一些基因已被证

明在干旱、高温等非生物胁迫中起重要作用[18-21]，

而 WRKY 家族通过调节激素类物质代谢帮助植

物抵抗逆境[22]。bHLH 家族则以结合作用，与其

他蛋白互作响应干旱胁迫[23]，说明干旱胁迫下

ERF 家族、MYB 家族、WRKY 家族和 bHLH 家

族在调控网络中起重要作用，‘赣南早’脐橙和‘纽

荷尔’脐橙对干旱胁迫耐受能力不同可能与转录

因子调控有关，有待进一步发掘与考证。

902 热带作物学报 第 43 卷

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热带作物学报 2022, 43(5): 904914

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2021-07-27；修回日期 2022-01-11

基金项目 海南省自然科学基金项目（No. 320QN336）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（No. 1630052017007，

No. 1251632021004）。

作者简介 王 丹（1984—），女，硕士，研究方向：热带作物蛋白质组学。*通信作者（Corresponding author）：徐兵强（XU

Bingqiang），E-mail：erger2002@163.com；仝 征（TONG Zheng），E-mail：tongzheng@foxmail.com。

橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸

化蛋白的鉴定

王 丹1

，徐兵强2*，孙 勇3

，彭存智1

，常丽丽1

，仝 征1*

1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101；2. 中国热带农业科学院海口实验站（热带果树研究所），

海南海口 571101；3. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州 571737

摘 要：橡胶树是合成天然橡胶的重要植物。PR107 和 CATAS8-79 是具有不同产排胶性状的 2 个无性系。在以往的研

究中，胶乳中蛋白表达差异被认为是影响天然橡胶合成的关键因子之一。然而，这 2 个无性系之间与胶乳产量相关的

蛋白质图谱尚未明确。本研究采用蛋白质组学方法对这些蛋白质进行鉴定，有助于探讨巴西橡胶树胶乳合成机理。经

双向凝胶电泳和质谱鉴定分析，共获得 65 个差异表达蛋白信息。通过磷酸化蛋白质组分析，在 PR107 胶乳中鉴定出

31 个磷酸化蛋白质，含有 74 个磷酸化氨基酸残基，在 CATAS8-79 胶乳中鉴定出 80 个磷酸化蛋白质，含有 166 个磷酸

化氨基酸残基。橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白（REF/SRPP）家族成员被鉴定为差异表达蛋白和磷酸化修饰蛋白，这些

蛋白在调节天然橡胶合成中起着重要作用。pro-hevein 和 hevamine 也表现出不同的磷酸化修饰水平，它们主要在天然

橡胶排胶过程中起作用。一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶激酶的磷酸化和去磷酸化修饰可能在天然橡胶合成中起调节作

用。这些结果为天然橡胶生物合成调控机制的研究提供了新的理论依据。

关键词：巴西橡胶树；天然橡胶生物合成；磷酸蛋白质组；双向凝胶电泳（2-DE）

中图分类号：S794.1 文献标识码：A

Comparative Proteomics Analysis and Identification of Phosphorylated

Protein in Latex of Rubber Tree Clones PR107 and CATAS8-79

WANG Dan1

, XU Bingqiang2*, SUN Yong3

, PENG Cunzhi1

, CHANG Lili1

, TONG Zheng1*

1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101,

China; 2. Haikou Experimental Station (Institute of Tropical Fruit Tree Research), Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 3. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou,

Hainan 571737, China

Abstract: Hevea brasiliensis is an important plant for producing natural rubber. RP107 and CATAS8-79 are two clones

of H. brasiliensis with different properties of rubber production and expulsion. The study of protein function in the latex

may help understand the regulatory mechanism related to the properties of rubber production and expulsion. This study

aimed to compare and analyze the difference in latex protein between RP107 and CATAS8-79 at the level of protein

accumulation and post-translational modification. Through the two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) analysis, 65

proteins derived from 88 spots were found to be accumulated differently in the latex between the 2 clones. Among the

proteins, 44 proteins had high accumulation in the latex of PR107 and 21 had high accumulation in the latex of

CATAS8-79. The high-accumulation proteins (HAPs) in the latex of CATAS8-79 were involved in intracellular organelles, external encapsulating structure, and membrane-bound organelles in terms of cellular component, and most of

them had drug-binding activity and hydrolase activity. Different from CATAS8-79, the HAPs in the latex of PR107 par-

第 5 期 王 丹等：橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定 905

ticipated in a catalytic complex, nonmembrane-bound organelles, and apoplasts. Most of them had protein-binding and

transferase activities. Furthermore, some proteins related to natural rubber synthesis and latex agglutination were found

in DAPs. The rubber elongation factors (REFs) and small rubber particle proteins (SRPPs) were identified. The two

classes of proteins played an important role in natural rubber biosynthesis in rubber trees. Some proteins mediating

rubber particle aggregation (RPA) and participating in response to tapping were found in DAPs too. To determinate the

phosphorylated proteins and amino acids in the latex of the two clones, the phosphopeptides were enriched using a

Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit and shotgun analysis was performed through the high-throughput Tandem Mass

Spectrometer (MS/MS). 74 phosphorylated amino acid residues derived from 31 phosphorylated proteins, as well as 166

phosphorylated amino acid residues derived from 80 phosphorylated proteins, were identified in PR107 and CATAS8-79,

respectively. Among the phosphorylated proteins, 25 proteins of PR107 and 74 proteins of CATAS8-79 were specific in

terms of the phosphorylation amino acids. Between the two clones, the members of REF/SRPP protein family, which

regulate the synthesis of nature rubber (NR) in the latex, have high differentiation capacity at both protein accumulation

and phosphorylation modification levels. The pro-hevein and hevamine proteins, which influence the process of rubber

expulsion, also showed diversity at the phosphorylation modification level. The phosphorylation and dephosphorylation

of an serine/threonine protein phosphatase kinase might play a regulatory role in NR synthesis. The results could provide a new theoretical basis for the study of the regulatory mechanism of NR biosynthesis.

Keywords: Hevea brasiliensis; natural rubber biosynthesis; phosphoproteome; two-dimensional gel electrophoresis (2-DE)

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.004

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是目前最具

商业价值的天然橡胶来源[1]。天然橡胶是在橡胶

树树皮下韧皮部乳管系统的乳管细胞中合成的，

适当的割破树皮会获得胶乳[2]。自首次证明胶乳

中含有蛋白质以来[3]，采用蛋白质组学技术研究

发现，胶乳蛋白参与诸如天然橡胶的生物合成、

对病原体的防御、伤口愈合和抗应激能力等代谢

途径的调控[4]。基于双向凝胶电泳技术（2-DE）

结合质谱的鉴定技术首先应用于胶乳及其亚细胞

组织中蛋白质的检测，确定胶乳中含有乳胶过敏

原类蛋白质[5]、几丁质酶类蛋白[6]以及包括橡胶延

伸因子（REF）/小橡胶粒子蛋白（SRPP）在内的

天然橡胶合成关键蛋白[7]。随着质谱技术的发展，

高通量非凝胶液质连用质谱检测技术应用于胶乳

蛋白质研究，大量胶乳蛋白质及其翻译后修饰位

点被成功鉴定[8-10]，稳定同位素标记相对和绝对

定量（iTRAQ）技术的应用部分揭示了橡胶树胶

乳中天然橡胶生物合成调控机制[11-12]。目前，虽

然巴西橡胶树胶乳中蛋白质功能的研究取得一定

突破，但这些蛋白参与的代谢途径的确切调控机

制仍不清楚，胶乳中与天然橡胶产量密切相关的

调控机理尚未明确。

巴西橡胶树的产量是由不同因素决定的，其

中一个关键因素是割胶后排胶的持续时间。几丁

质酶，β-1,3-葡聚糖酶，hevein 蛋白以及 hevein

蛋白前体与细胞骨架结合一起形成了阻碍胶乳流

出的蛋白质网络，缩短了排胶时间[13]。类糊精中

的几丁质酶和葡聚糖酶作为凝固因子在橡胶颗粒

聚集中起着关键作用 [14] 。对橡胶树无性系

CATAS7-33-97 和 CATAS8-79 进行比较分析发现，

水通道蛋白基因和乙烯生物合成关键基因表达增

加，胶乳凝集因子基因表达减少等促进了割胶后

排胶的过程[15]。随着胶乳中茉莉酸途径和甲羟戊

酸途径（MVA）的激活，质膜内在蛋白、蔗糖转

运体、蔗糖合酶和 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A

（HMG-CoA）合酶促进了天然橡胶的合成[15]。

然而，在橡胶树高产和低产品系之间，天然橡胶

生物合成途径相关基因的表达水平没有发现显著

差异[16]。

橡胶树无性系 PR107 由印度尼西亚培育[17]。

对 PR107 的胶乳合成特性分析表明，PR107 具有

较强的蔗糖代谢和基础代谢能力，能优先利用蔗

糖合成天然橡胶，具有较强的抵御非生物胁迫能

力[16]。CATAS8-79 是中国热带农业科学院自主培

育的一个无性系，具有高产、早熟等优良性状[18]。

CATAS8-79 的流速和排胶持续时间高于

PR107[19]。基于 CATAS8-79 和 PR107 之间的胶乳

转录组测序及差异表达分析，发现内源性乙烯水

平、乳管细胞壁木质素含量和葡聚糖酶的表达与

排胶持续时间有关[19]。这 2 个无性系的差异基因

组学、蛋白质组学和转录组学分析可以揭示天然

橡胶合成的一些分子机制。

蛋白质翻译后修饰（PTM）是天然橡胶合成

途径的重要调控方式之一。在这个过程中，一些

906 热带作物学报 第 43 卷

激酶对蛋白质的磷酸化起着重要的作用。羟甲基

戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）是 MVA 途径中

的一种关键酶，调节巴西橡胶树的天然橡胶合成

途径[20]。SUGDEN 等[21]发现 SNF1 相关蛋白激酶

（SnRK1）对 HbHMGR1 活性的影响主要是调节

其 Ser577 氨基酸残基的磷酸化水平。在菠菜叶中，

SnRK1 通过调节 HMGR 蛋白的非活化的 Ser577

氨基酸位点的磷酸化来调控类异戊二烯和蔗糖的

合成。一些研究还表明，天然橡胶合成相关蛋白

的 PTMs 是橡胶树的重要调控机制。在

CATAS7-33-97 中，许多与橡胶生物合成相关的蛋

白质被磷酸化。从 16 种橡胶延伸因子（REF）和

7 种小橡胶粒子蛋白（SRPP）异构体中鉴定出 138

种独特的磷酸化肽，包含 129 种磷酸化氨基酸[12]。

TONG 等[22]也发现 PR107 和 CATAS8-79 中有许

多 REF 和 SRPP 被磷酸化，其中一些是 PR107 或

CATAS8-79 所特有的。

尽管橡胶合成相关蛋白的磷酸化修饰是一种

常见现象，但蛋白质磷酸化与天然橡胶合成之间

的关系尚未被揭示。本研究的目的是通过蛋白质

组学分析，发现 PR107 和 CATAS8-79 胶乳蛋白之

间的差异积累和磷酸化修饰蛋白信息，为天然橡

胶生物合成调控机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以橡胶树无性系 PR107 和 CATAS8-79 为研

究对象，PR107 是由云南省热带作物科学研究所

于 1957年由印度尼西亚引进的优良无性系品种，

因其在栽培中后期的橡胶产量、耐刺激割胶、抗

病性、立木材积量等方面表现优良，于 1962 年

选为云南大规模推广种植品种[17]。CATAS8-79

是从 1973 年‘热研 88-13’（母本）和‘热研 217’

（父本）的人工授粉苗中选出建立的具备早熟高

产优良性质的无性系，2001 年通过全国农作物品

种审定委员会审定[18]。研究用橡胶树种植在中国

热带农业科学院儋州市试验农场。从每个无性系

中选择 30 棵树（8 年树龄，未开割）进行分析。

1.2 方法

1.2.1 胶乳采集及相关指标测定 割胶后，丢弃

前 20 滴胶乳，在冰上用离心管收集随后排出的胶

乳。收集的胶乳被带回实验室作进一步分析。收

集割胶后 1 min 内流出的胶乳，检测胶乳体积，

计算初始胶乳流速。同时收集割胶后流出的所有

胶乳，当 2 滴胶乳滴落间隔超过 1 h 后停止收集，

测定胶乳产量。每个生理指标测定 30 个生物学

重复。

1.2.2 蛋白质提取及双向电泳 胶乳中的蛋白质

提取过程如下：将 3 mL 胶乳添加到 5 mL 冷提取

缓冲液（100 mmol/L 乙二胺四乙酸、50 mmol/L

维生素 C、50 mmol/L 硼砂、1%Triton X-100、1%

交联聚乙烯吡咯烷酮 PVPP、2% β-巯基乙醇、30%

蔗糖和 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）。旋涡震荡

10 min 后，向管中加入 8 mL Tris 饱和苯酚

（pH>7.8），震荡 10 min，随后 4℃，15 000 g，

离心 15 min。收集上层酚相，加入 5 倍体积的预

冷过饱和硫酸铵甲醇溶液，在–20℃沉淀 12 h。沉

淀用冰甲醇和丙酮洗涤，自然干燥，沉淀用蛋白

质裂解缓冲液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、2%

3-[（3-胆酰胺丙基）二甲氨基]-丙磺酸盐 CHAPS、

1%IPG 缓冲液、13 mmol/L 二硫苏糖醇 DTT）重

新溶解。以 BSA 作为标准品，用 Bradford 法测定

蛋白质样品的浓度。

从 2 个无性系的胶乳中提取各 1300 μg 蛋白

质样品加入线性梯度 IPG 条（24 cm，pH 4~7）中，

在 25℃下持续水化 18 h。等电聚焦后，用含有 1%

DTT 的溶液 ES（50 mmol/L Tris pH 8.8，30%甘

油，6 mol/L 尿素，2%SDS 和 0.002%溴酚蓝）平

衡 15 min，用含有 4% 碘乙酰胺的 ES 平衡

15 min。经 SDS-PAGE（12.5%）进行蛋白质的

电泳分离。凝胶用考马斯亮蓝染料染色 12 h，并

用图像扫描仪 III 获取凝胶图谱。使用

ImageMaster 2D Platinum 软件进行图像分析。每

组样品进行 3 次生物学重复。

1.2.3 差异积累蛋白质的质谱鉴定 在 3 个生物

学重复中，蛋白质相对表达丰度变化量大于 2 倍

的蛋白点称为差异积累蛋白点（DAP）。人工切除

凝胶上的 DAP 斑点并进行胰蛋白酶消化，大致过

程如下：在室温下用 50%乙腈（V/V）/50 mmol/L

NH4HCO3 溶液脱色至胶粒透明，在 37℃条件下用

含有 5 pmol 胰蛋白酶的 100 mmol/L NH4HCO3 酶

解 16 h。瞬时离心后，取 0.8 µL 酶解液加在基质

辅助激光解吸电离（MALDI）板（384 Opti-TOF）

样品位上，待其干燥后，再向每个样品上加入

0.8 µL 5 mg/mL 基质（氰基 -4- 羟基肉桂酸

（CHCA）溶解于 50%乙腈和 0.1%三氟乙酸）。

待样品完全干燥后，用 5800 MALDI-TOF/TOF 质

谱仪进行鉴定。质谱数据通过 Protein Pilot 软件

第 5 期 王 丹等：橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定 907

（5.0 版）进行分析，并根据 NCBI 数据库进行检

索 (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Hevea_brasiliensis/protein/)，该数据库包括 58 062 个蛋白序

列和 27 683 334 个多肽信息。DAPs 的成功鉴定标

准为肽段评分大于 32，P 值小于 0.05，至少匹配 2

条可信多肽，匹配氨基酸序列覆盖率大于 4%。

1.2.4 抗体制备及蛋白表达量检测（Western

blotting） 构建携带 DAPs 目的基因的重组质粒

pET-30a，并将其转化到大肠杆菌（Rosetta DE3）。

用 0.5 mmol/L IPTG 对重组大肠杆菌进行蛋白诱

导。目的蛋白经 His 标记纯化。分别用 Freund 完

全佐剂和 Freund 不完全佐剂乳化后，分次皮下注

射新西兰大白兔，经多次免疫后获得含有多克隆

抗体的兔血清。获得的抗体血清用于 PR107 和

CATAS8-79 胶乳样品中蛋白表达量的检测：10 μg

胶乳蛋白样品经 SDS-PAGE 电泳分离，将凝胶中

的蛋白电转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂牛奶封闭

PVDF 膜。用 DAPs 多克隆兔抗体和 HRP 结合抗

兔 IgG 孵育 PVDF 膜。PVDF 膜在黑暗的环境中

经试剂盒显色和并用 LAS-4000 微型成像仪检测

DAPs 蛋白条带的图像。所有的 Western blotting

进行 3 次生物学重复。

1.2.5 PR107 和 CATAS8-79 胶乳磷酸化蛋白的富

集与鉴定 分别取 1 mg PR107 和 CATAS8-79 的

胶乳蛋白用于磷酸化蛋白鉴定，酶解后的多肽使

用 Pierce Fe NTA 磷酸肽富集试剂盒富集磷酸肽：

将酶解后的肽段用 200 μL结合缓冲液重新悬浮并

加载到 Fe-NTA 自旋柱。在室温下孵育 20 min 后，

将柱转移到微型离心管中，并在室温下以 1000 g

离心 1 min。使用 C18 柱和 UltiMate 3000 系统收

集并分离磷酸肽。将收集的组分通过 HPLC

（Dionex Ultra 3000 nano）-ESI-MS/MS（TripleTOF 5600，ABsciex）系统进行分离鉴定。质谱原

始数据使用 ProteinPilot 软件 V5.0（ABsciex）分

析，获得磷酸化蛋白质和氨基酸位点的信息。质

谱鉴定成功的标准：未使用的置信度得分≥1.3，

至少有 2 个匹配的多肽具有高于 95%的置信度和

低于 1%的错误发现率（FDR），所有的样品进行

3 个生物学重复。

1.2.6 生物信息学分析 使用 Blast2-GO 软件对

来自 2-DE 的 DAPs 和不同磷酸化蛋白进行 GO 基

因通路分析，使用 WEGO 软件进行 GO 基因富集

分析（http://wego.genomics.org.cn/）。

2 结果与分析

2.1 PR107 和 CATAS8-79 胶乳指标测定

测定了无性系 PR107和 CATAS8-79的胶乳流

速后发现，2 个无性系间差异极显著。在 CATAS8-

79中，割胶后的第1分钟内收集到约为(4.1±0.5)mL

胶乳，而在 PR107 中只收集到(2.5±0.3)mL 胶乳

（图 1A）。测量了来自同一无性系的不同植株的

胶乳产量，其中 CATAS8-79 收集到(139±25.6)mL

胶乳，而 PR107 仅收集到(53±13.9)mL 胶乳（图

1B）。

***表示处理间差异极显著（P<0.001）。

***indicates extremely significant difference among

treatments (P<0.001).

图 1 橡胶树 PR107 与 CATAS8-79 胶乳流出初速度

及产胶量的差异

Fig. 1 Difference in initial velocity of latex flow and

latex yield of rubber tree between PR107 and

CATAS8-79 after tapping

2.2 PR107 和 CATAS8-79 胶乳中差异积累蛋

白质的鉴定及分析

经胶乳蛋白质提取及双向凝胶电泳分离后，

在无性系 PR107 的凝胶上检测到丰度 Vol>0.01%

的蛋白点 1301±87 个，丰度在 0.005%~0.01%之间

的蛋白点 660±47 个。在无性系 CATAS8-79 的凝

胶上，检测到丰度 Vol>0.01%的蛋白点 1132±63

个，0.005%~0.01%之间的蛋白点 634±23 个。其

中 88 个蛋白点的丰度发生了 2 倍及以上的变化

（P<0.05）。PR107 凝胶中检测到 64 个蛋白斑点

的丰度高于 CATAS8-79 凝胶中相同蛋白斑点 2 倍

以上（图 2A）。CATAS8-79 凝胶中检测到 24 个蛋

白斑点的丰度高于 PR107 凝胶中的 2 倍以上（图

908 热带作物学报 第 43 卷

2B ）。这些斑点中含有的蛋白是 PR107 和

CATAS8-79 胶乳中差异积累蛋白质。使用

MALDI-TOF/TOF-MS 对 88 个蛋白斑点进行了鉴

定，成功鉴定到 65 种差异蛋白质。其中 44 个蛋

白 在 PR107 胶乳中有高积累，21 个蛋白在

CATAS8-79 胶乳中有高积累。

A：PR107 胶乳蛋白质 2-DE 凝胶图谱；B：CATAS8-79 胶乳蛋白质 2-DE 凝胶图谱；C：Western blot 法

检测 2 个无性系胶乳中 DAPs 的积累情况。

A: The protein profiles of PR107 latex with MS identification of DAPs; B: The protein profiles of CATAS8-79 latex with MS

identification of DAPs; C: The western blot analysis of DAPs in latex from two clones.

图 2 PR107 和 CATAS8-79 胶乳蛋白质凝胶图谱

Fig. 2 Protein profiles of PR107 and CATAS8-79 latex with MS identification of DAPs

在这些差异蛋白中发现了一些与天然橡胶合

成和胶乳凝集有关的蛋白质，并通过 Western blot

进行验证（图 2C）。含有 258 个氨基酸的 27.3-kDa

REF（REF258, ref|XP_021653592.1）的 7 种异构

体在 2 个无性系的胶乳中显示出差异积累（点 13、

14、18、24、67、68 和 73，表 1）。这些异构体

具有不同的等电点（pI）和分子量（MW）。其中

3 个（点 67、68 和 73）在 PR107 胶乳中积累较

高，而在 CATAS8-79 中积累较低。含有 175 个氨

基酸的 19.6-kDa REF （ REF175, ref|XP_

021653600.1）的 2 个异构体（点 77 和 78）在 PR107

胶乳中积累较高，一个异构体（点 19）在 PR107

胶乳中积累较低。与 REF 不同，含有 204 个氨基

酸 的 22.3-kDa SRPP （ SRPP204, ref|XP

021653597.1）的 2 种异构体（点 74 和 75）和含

有 243 个氨基酸的 27.1-kDa SRPP（SRPP243,

ref|XP 021662186.1）的一种异构体（点 62）在 2

个无性系之间具有不同的表达水平，并且在

PR107 的胶乳中具有较高的积累。乙酰辅酶 A 乙

酰转移酶在 PR107 的胶乳中有较高的积累（点 41

和 43）（表 1，图 2A 和图 2B），该蛋白是橡胶生

物合成中二磷酸异戊烯酯的来源，与橡胶产量和

品质密切相关。

一些介导橡胶颗粒聚集（RPA）和参与割胶

反应的蛋白质也被成功鉴定。在 PR107 中，橡胶

蛋白前体 pro-hevein（spot 85）在胶乳中有较高的

积累（表 1，图 2C）。热休克 70 kDa 蛋白的 2 种

异构体（点 26 和 28）在 PR107 胶乳中存在积累

差异，而在 CATAS8-79 胶乳中仅检测到一种异构

体（点 1）存在差异（表 1，图 2C）。2 个无性系

之间的 western 印迹也证实了胶乳中的 pro-hevein

和热休克 70 kDa 蛋白积累的差异（图 2C）。

第 5 期 王 丹等：橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定 909

表 1 2-DE 凝胶电泳分离的 PR107 和 CATAS8-79 胶乳中关键 DAPs 质谱鉴定信息

Tab. 1 Information of key DAPs in latex of PR107 and CATAS8-79 identified by MS from 2-DE gel

点编号

Spots No.

蛋白名称

Protein name

得分

Score

等电点

pI

分子量

MW/Da

差异比值

Relative V.R.

P 值

P value

1 heat shock 70 kDa protein 8-like 63 5.38 62 933 0.2792 0.0021

13 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 351 5.21 25 299 0.4661 0.0148

14 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 218 5.21 25 299 0.2568 0.0001

18 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 379 5.21 25 299 0.2990 0.0028

19 rubber elongation factor protein-like (REF175) 48 5.28 19 612 0.4933 0.0226

24 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 205 5.21 25 299 0.4276 0.0211

26 heat shock cognate 70 kDa protein 2 isoform X1 109 5.14 71 451 2.3072 0.0411

28 heat shock cognate 70 kDa protein 2 isoform X1 236 5.14 71 451 2.7902 0.0047

41 acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1 598 6.01 41 646 2.1497 0.0026

43 acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1 525 6.01 41 646 2.5920 0.0210

62 REF/SRPP-like protein At3g05500 (SRPP243) 155 6.36 27 100 2.7989 0.0161

67 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 303 5.21 25 299 4.5117 0.0037

68 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 350 5.21 25 299 2.5995 0.0266

73 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF258) 67 5.21 25 299 2.5393 0.0213

74 small rubber particle protein isoform X1 (SRPP204) 196 4.80 22 331 4.4673 0.0149

75 small rubber particle protein isoform X1 (SRPP204) 265 4.80 22 331 2.1722 0.0404

77 rubber elongation factor protein-like (REF175) 154 5.28 19 612 54.2933 0.0003

78 rubber elongation factor protein-like (REF175) 120 5.28 19 612 30.0239 0.0003

85 pro-hevein 48 5.89 23 154 3.0820 0.0030

注：点编号表示 2-DE 凝胶上点的编号；差异比值表示凝胶上 2 个无性系间的差异蛋白点丰度值的比值（PR107/CATAS8-79）。

Note: Spots No. indicates the spot number of the identified proteins on the 2-DE gel; Relative V.R. indicates the relative volume ratios

(PR107/CATAS8-79) of the protein abundance for DAP with gels.

此外， CATAS8-79 胶乳中的高积累蛋白

（HAPs）在细胞成分上涉及胞内细胞器、外包囊

结构和膜结合细胞器，其中大部分具有药物结合

活性和水解酶活性。与 CATAS8-79 不同，PR107

胶乳中的 HAPs 参与催化复合物、非膜结合细胞

器和质外体，大多数具有蛋白质结合和转移酶活

性。在 CATAS8-79 中，大多数 HAPs 参与初级代

谢过程、有机物代谢过程、氮化合物代谢过程和

分解代谢过程。此外，参与毒素分解代谢过程的

蛋白质在 CATAS8-79 的胶乳中具有高积累，而参

与响应非生物和生物刺激的蛋白质在 PR107 的胶

乳中具有高积累（图 3A）。

2.3 PR107 和 CATAS8-79 胶乳中磷酸化蛋白

质的鉴定

在 PR107 胶乳中鉴定出 31 个磷酸化蛋白，含

有 74 个磷酸化氨基酸，置信度高于 95%。这些磷

酸化氨基酸包括 56 个丝氨酸残基、13 个苏氨酸残

基和 5 个天冬氨酸残基。在 CATAS8-79 胶乳中共

鉴定出 80 种磷酸化蛋白，含有 166 个磷酸化氨基

酸，这些磷酸化氨基酸包括 141 个丝氨酸残基、22

个苏氨酸残基和 3 个天冬氨酸残基。在这些磷酸化

蛋白中，有 9 个磷酸化蛋白包含 17 个磷酸化氨基

酸（14 个丝氨酸残基和 3 个苏氨酸残基）只是在

PR107 中鉴定到，有 58 个磷酸化蛋白包含 103 个

磷酸化氨基酸（92 个丝氨酸残基和 11 个苏氨酸残

基）只在 CATAS8-79 中鉴定到。在 PR107 中，更

多的磷酸化蛋白参与构成多种细胞成分，如膜、共

质体、细胞连接和细胞外区域。在 CATAS8-79 中，

更多的磷酸化蛋白参与多细胞组织过程、细胞成分

组织或生物发生、色素沉着和免疫系统过程。与

PR107 相比，在 CATAS8-79 的胶乳中发现更多具

有催化活性的蛋白质被磷酸化修饰（图 3B）。

在这些磷酸化蛋白中，有 7 种蛋白参与了天

然橡胶的合成、胶乳再生和胶乳排出时间的调控，

但是它们在不同橡胶树无性系中的磷酸化修饰位

点不同。在 PR107 中，REF258 的第 49 个氨基酸

残基被磷酸化（Ser49th），而在 CATAS8-79 中，

是第 3 个氨基酸残基被磷酸化（Ser3rd）（表 2，

图 4）。REF138 的 asp80、asp100 和 asp107 仅在

PR107 中发生磷酸化。SRPP117 的 Ser45th、

SRPP204 的 Ser26th、SRPP243 的 Ser109th 和

HMGR 的 Ser20th 仅在 CATAS8-79 中发生磷酸化

修饰（表 2 和图 4）。pro-hevein 在 PR107 和

CATAS8-79 胶乳中的磷酸化程度不同（表 2）。

910 热带作物学报 第 43 卷

H-p in PR107：PR107 胶乳中的高积累蛋白；H-p in CATAS8-79：CATAS8-79 胶乳中的高积累蛋白；P-p in PR107：

PR107 胶乳中磷酸化的蛋白质；P-p in CATAS8-79：CATAS8-79 胶乳中磷酸化的蛋白质。

H-p in PR107: The high accumulation proteins in PR107 latex; H-p in CATAS8-79: The high accumulation proteins

in CATAS8-79 latex; P-p in PR107: The proteins phosphorylated in PR107 latex; P-p in CATAS8-79:

the proteins phosphorylated in CATAS8-79 latex.

图 3 PR107 和 CATAS8-79 乳胶中差异积累蛋白和差异磷酸化蛋白的功能分析

Fig. 3 Functional analyses of DAPs and differential phosphorylated proteins in PR107 and CATAS8-79 latex

PR107 胶乳蛋白中磷酸化氨基酸的位置用灰色气球状标记标出；

CATAS8-79 胶乳蛋白质中磷酸化氨基酸的位置用白色气球状标记标出。

The positions of phosphorylation amino acids in the proteins from PR107 latex are marked by gray balloon

shape; The positions of phosphorylation amino acids in the proteins

from CATAS8-79 latex are marked by white balloon shape.

图 4 天然橡胶生物合成和胶乳流动相关蛋白质磷酸化氨基酸示意图

Fig. 4 Schematic diagrams of phosphorylation amino acids and the multiple domains of

proteins related to natural rubber biosynthesis

表 2 2 个橡胶树无性系胶乳中关键磷酸化蛋白和磷酸化氨基酸位点信息

Tab. 2 Key phosphorylated protein and amino acid sites in different Hevea clones

磷酸化氨基酸位点

Phosphorylation amino acid sites

磷酸化蛋白编号

The Phosphorylated protein

number

序列登陆号

Accession #

蛋白名称

Protein name

PR107 CATAS8-79

1 ref|XP_021671430.1 hevamine-A-like 157 T 157 T

2 ref|XP_021641666.1 hsp70-Hsp90 organizing protein 3-like 120 S, 122 S 122 S

3 ref|XP_021653585.1 stress-related protein-like 3 S, 8 S, 10 T,

18 T, 20T, 21 S

8 S, 10 T, 20 T, 21 S

4 ref|XP_021653593.1 rubber elongation factor protein-like isoform X1 (REF 258) 9 S, 49 S, 71 S, 74 S 3 S, 9 S, 71 S, 74 S

5 ref|XP_021653597.1 small rubber particle protein isoform X1 (SRPP204) 184 S, 185 S 26 S, 184 S, 185 S

第 5 期 王 丹等：橡胶树 PR107 和 CATAS8-79 中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定 911

续表 2 2 个橡胶树无性系胶乳中关键磷酸化蛋白和磷酸化氨基酸位点信息

Tab. 2 Key phosphorylated protein and amino acid sites in different Hevea clones (continued)

磷酸化氨基酸位点

Phosphorylation amino acid sites

磷酸化蛋白编号

The Phosphorylated protein

number

序列登陆号

Accession #

蛋白名称

Protein name

PR107 CATAS8-79

6 ref|XP_021653602.1 rubber elongation factor protein (REF138) 4 D, 6 D, 80 D, 82 T,

100 D, 102 S, 107 S,

118 S, 121 S, 122 S,

127 T

4 D, 6 D, 82 T,

102 S, 118 S, 121 S,

122 S, 127 T

7 ref|XP_021672285.1 pro-hevein-like 155 D, 158 S, 196 S 149 T, 155 D, 158 S

8 ref|XP_021682526.1 pleckstrin homology domain-containing protein 1-like 130 S 130 S, 132 T

9 ref|XP_021690193.1 SNF1-related protein kinase regulatory subunit gamma-1 19 S, 43 S –

10 ref|XP_021653583.1 stress-related protein-like – 27 S

11 ref|XP_021653604.1 small rubber particle protein-like isoform X2 (SRPP117) – 45 S

12 ref|XP_021659098.1 pleckstrin homology domain-containing protein 1-like – 130 S, 132 T

13 ref|XP_021659443.1 serine/threonine-protein kinase tricorner-like isoform X1 – 34 S, 157 S, 312 S,

323 T

14 ref|XP_021662186.1 REF/SRPP-like protein At3g05500 (SRPP243) – 109 S

15 ref|XP_021684968.1 serine/threonine protein phosphatase 2A regulatory subunit

B''beta-like

– 118 S

16 ref|XP_021686529.1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 1 (HMGR) – 20 S

一些参与应激反应和细胞内信号转导的蛋白

质在PR107和CATAS8-79之间也具有不同的磷酸

化位点。在 PR107 胶乳中，Hsp70-Hsp90 组织蛋

白 3（ref|xp_021641666.1）和应激相关蛋白（ref|xp_

021653583.1 和 ref|xp_021653585.1）中发现了更

多的磷酸化氨基酸（表 2）。此外，在信号转导过

程中起重要作用的 pleckstrin 同源结构域蛋白质

（ref|xp_021682526.1 和 ref|xp_021659098.1）在

CATAS8-79 中有更多的氨基酸残基被磷酸化修饰。

3 讨论

3.1 橡胶蛋白前体和几丁质酶的积累和磷酸

化差异可能是影响胶乳凝集的重要因素之一

在巴西橡胶树胶乳的 C-血清、橡胶粒子和黄

色体中，小橡胶粒子蛋白（SRPP）、葡聚糖酶

（glucanase）、hevamine、hevein 等蛋白通常与胶

乳凝集有关[14, 23]。在本研究中，CATAS8-79 的流

速和总产胶量明显高于 PR107，CATAS8-79 中这

些相关蛋白的表达或修饰情况可能会更倾向于增

加胶乳的流动性，相互作用共同保持其较高的初

始流速及最终高的产量。作为一种凝集素蛋白，

橡胶树蛋白前体（pro-hevein）通过与橡胶粒子膜

相互作用而显示出各种凝集特性[24]。pro-hevein

的 N 端结构域带有几丁质结合基序，C 端结构域

可以与几丁质结合活性协同提供凝集活性[25]。在

本研究中，PR107 中 pro-hevein 的丰度是 CATAS8-

79 的 3.08 倍。它也被鉴定为磷酸化蛋白，在

CATAS8-79 中，Pro-hevein 在 Barwin 样结构域的

Thr149 处被磷酸化，该位置是一个 C 末端诱导结

构域[24]。然而，在 PR107 中，pro-hevein 的磷酸

化位点位于 Ser196th，更接近 C 末端（表 2 和图

4）。本研究认为 Pro-hevein 的表达量和磷酸化修

饰的差异可能是影响 PR107和CATAS8-79胶乳流

出速度和产量的因子之一。

hevamine 是一种具有溶菌酶和几丁质酶活性

的植物防御蛋白[26]。在橡胶树中，hevamine 通过堵

塞乳管防止胶乳排出[27]。诸多研究表明几丁质酶是

决定割胶后胶乳流动持续时间的关键成员之一，在

CATAS8-79 中，割胶后胶乳几丁质酶基因（HbChit）

下调表达[24]。在本研究中，2 个橡胶树无性系中

的 hevamine-A 样蛋白（ref|xp_021671430.1）氨基

酸残基的 Thr157th 均发生磷酸化修饰，但在

PR107 的胶乳中检测到更多含有 Thr157th 磷酸化

位点的多肽，Thr157th 位点的磷酸化修饰可能是

hevamine-A 行使其功能的重要修饰之一。

在胶乳凝集过程中，胶乳凝集素蛋白存在于

黄色体膜上，与糖基化蛋白 SRPP 相互作用，充

当连接橡胶粒子的多价桥梁[28]。另一种可能是黄

色体破裂后，黄色体膜内的凝集素蛋白结合位点

暴露并与 SRPP 结合。橡胶粒子在黄色体膜碎片

上的聚集导致橡胶凝结[29]。SRPP 在胶乳凝集过

程中发挥重要作用。与 PR107 相比，CATAS8-79

912 热带作物学报 第 43 卷

胶乳中鉴定到 SRPP 上具备更多的磷酸化氨基酸

位点，SRPP 的不同磷酸化水平可能影响橡胶树胶

乳凝集过程。

3.2 磷酸化蛋白参与了 PR107 和 CATAS8-79

胶乳中橡胶合成的调控

天然橡胶的生物合成是橡胶树乳管的主要代

谢过程，这一过程涉及 20 多种酶反应[30]。在本

研究中，SRPP204 和 SRPP243 在蛋白表达水平和

磷酸化修饰层面均与橡胶产量存在一定的相关

性。REF258 蛋白 N 端的 ATP 酶 β-亚基结构域第

49 位的氨基酸残基仅在 CATAS8-79 胶乳中被磷

酸化修饰。REF138 中的 3 种氨基酸仅在 PR107

胶乳中磷酸化，REF/SRPP 家族成员极有可能通

过磷酸化修饰调控天然橡胶的合成。HMGR1 是

橡胶树胶乳中主要的胶乳代谢相关蛋白之一[20]。

天然橡胶产量与橡胶树中 HbHMGR1 表达水平显

著正相关[31]。在橡胶草中（Taraxacum kok-saghyz

R.），HMGR1 在高橡胶产量橡胶草中表达量比较

高，且与天然橡胶生产能力的相一致[32]。在本研

究中，PR107 和 CATAS8-79 之间胶乳中 HMGR1

的蛋白积累没有差异，但是 2 个橡胶树无性系之

间 HMGR1 在磷酸化水平上存在差异，可能与其

产胶性状相关。

3.3 蛋白磷酸化激酶参与了 PR107 和

CATAS8-79 胶乳的生物过程调控

蛋白质磷酸化是调节许多细胞过程的重要机

制，如原核生物和真核生物的细胞壁生物合成、

生物膜形成和应激反应[33]。各种氨基酸残基的磷

酸化可控制蛋白质–蛋白质相互作用和蛋白质聚

集体的形成[34]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可通过在

单个 N-末端丝氨酸（苏氨酸）残基处特异性磷酸

化来调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性[35]。在拟

南芥中，STN7（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 7 的同

源物）中丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的动态调节

对植物生长和环境适应至关重要[36]。丝氨酸/苏氨

酸蛋白激酶在调节膜相关功能、大分子生物合成

过程和脂质代谢中起着重要作用[37]。激酶很可能

通过自身的磷酸化和去磷酸化影响这些生物过

程。在本研究中，PR107 和 CATAS8-79 胶乳中一

些丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族蛋白的氨基酸残基

发生了磷酸化修饰并存在差异，这一发现暗示这种

激酶家族在 PR107 和 CATAS8-79 的乳管细胞壁形

成及应激反应过程中可能存在不同的调控机制。

4 结论

橡胶树无性系 PR107 与 CATAS8-79 在胶乳产

量和割胶后胶乳排出持续时间上存在一定的差

异。为了揭示天然橡胶合成和排胶的分子机理，

本文对 PR107和CATAS8-79的胶乳差异表达蛋白

质和磷酸化蛋白质进行了比较分析。共检测到 88

个差异蛋白点含有 65 个差异积累蛋白。其中 44

个蛋白在 PR107 胶乳中有较高的积累量，21 个蛋

白在 CATAS8-79 胶乳中有较高的积累量，在

CATAS8-79 胶乳中鉴定出 80 个独特的磷酸化蛋

白，包含 166 个磷酸化氨基酸。通过生物信息学

分析，推测 REF/SRPP 超家族成员在 2 个无性系

中通过蛋白表达和 PTM 调控天然橡胶合成的机

制不同。基于某些形式的磷酸化修饰，橡胶蛋白

前体和几丁质酶可能在胶乳凝集过程中起重要作

用。一种丝氨酸–苏氨酸蛋白磷酸酶激酶家族成员

的磷酸化和去磷酸化也可能参与天然橡胶的合成

和胶乳的排出。

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