三、耐热（粪）大肠菌群
Fecal Coliforms
1 范围
本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。
本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。
2 定义
本规范采用下列定义
粪大肠菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，
在 44.5℃培养 24h～48h 能发酵乳糖产酸并产气。
该菌来自人和温血动物粪便，是重要的卫生指示菌。
3 仪器
恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
温度计。
显微镜。
载玻片。
接种环。
电炉。
三角瓶。
试管。
小倒管。
pH 计或 pH 试纸。
高压灭茵器。
刻度吸管：10mL、2mL、1mL。
平皿。
4 培养基和试剂
双倍乳糖胆盐培养基
成分： 蛋白胨 40g
猪胆盐 10g
乳糖 10g
%溴甲酚紫水溶液 5mL
蒸馏水 1000mL
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调 pH 到，加入%溴甲酚紫水溶液
5mL，混匀，分装试管(每支试管中加一个小倒管)。 (10 lb)20min 灭菌。
伊红美兰(EMB)琼脂
成分： 蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 20g
2%伊红水溶液 20mL
%美蓝水溶液 13mL
蒸馏水 1000mL
制法：先将琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白
胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至 1000mL。校正 pH 值为～，分装于三角瓶
内，(15 lb)15min 高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至 60℃左右
无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。
蛋白胨水(作靛基质试验用)
成分： 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
制法：将上述成分加热融化，调 pH 值为～，分装小试管，(15 lb)15min 高压
灭菌。
靛基质试剂
柯凡克试剂：将 5g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中，然后缓慢加入浓盐
酸 25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于 44±0.5℃培养 24h。 沿管壁加柯凡克
试剂～，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后
方可使用。
革兰氏染色液：
4.5.1 染液制备
4.5.1.1 结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水加至 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加
蒸馏水至 300mL。
4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。
4.5.1.4 复染液：
a. 沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95%乙醇 10mL
蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红 10g，研细，加 95%乙醇 100mL，放置过夜，
滤纸过滤。取该液 10mL，加 5%石碳酸水溶液 90mL 混合，即为石碳酸复红液。再取
此液 10mL 加水 90mL，即为稀石碳酸复红液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗。
4.5.2.3 滴加 95%乙醇脱色，约 30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙
醇滴满整个涂片，脱色 10s，水洗。
4.5.2.4 滴加复染液，复染 1min，水洗，待干，镜检。
4.5.3 染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：如用 1:10 稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需 10s。
5 操作步骤
取 10mL 1:10 稀释的检液，加到 10mL 双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置 44℃±
0.5℃培养箱中培养 24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置 37℃培养 18 h～24 h。同时取
该培养液 1～2 滴接种到蛋白胨水中，置 44℃±0.5℃培养 24h。
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂
培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光
泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为
粪大肠菌群，应注意挑选。
挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰
红色；阴性反应液面呈试剂本色。
6 检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛
基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
